Антибиотик тавримицин и способ егополучения

Антибиотик тавримицин и способ егополучения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

и пс

О П И-C- A Н:И---Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических республик

{iij677497

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТВЯЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 24 ) 377 (21) 2465191/28-13 (51)М. Кд з

С 12 D 9/14 с присоедине иемзаявкийоГосударственный комитет

СССР но делам изобретеийй и открытий (23} Приоритет

Опубликовано 0708р1. Бюллетень 89 29 (53) УДК 615.45: 6 .779.93! (088. S) Дата опубликования описания 07.0881. (72) Авторы изобретения

В.И. Фролова, A.Ä. Кузовков, М.N. Тайг, Л.П. Иваницкая, С.М. Навашин, Т.Г. Терентьева и Б.В. Роэынов (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (54) АНТИБИОТИК ТАВРИМИЦИН И СПОСОБ ЕГО

ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к микробио-".. логической пронвиаленности, а именно к производству антибиотиков.

Предлагаевый антибиотик таврнмацин является новым, и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение нового противоопухолевого антибиотика тавримицина.

Эта цель достигается тем, что штамм Actinomyces tauricus 7036-1 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, выделяют целевой продукт и при необходимости разделяют на тавримицнн А и тавримицин В.

Антибиотик тавримицин брутто-формулы

С„„Н„О Я, где и 51 - тавримицин A u n = 49 таврнмицин В.

Молекулярная масса тавримицина

А 813, тавримицина В - 811.

Максимумы поглощения в УФ-спектре (в спиртовом растворе) при 235,257, 292, 466, 482, 494, 515 и 527 нм.

Полосы поглощения в ИК-спектре (в КВч-диске)г 3450, 2945, 2870, 1740, 1610 см

Порощок оранжевого цвета, раство- ,рим в хлороформе, диметилформамиде, .этилацетате, спирте, метаноле, водных растворах кислот и щелочей, ацетонет Не растворим в воде, серном и нетролейном эФирах, гексане.

Разбавленный раствор антибиотика в нейтральной среде окрашен в оран© жевый цвет, при подщелачиванни становится фиолетовым.

Глюкозид гидролизуется соляной кислотой, образуя агликон и три сахара.

15 Антибиотик тавримицин синтезируется культурой антиномицета А@ст

nomyces tauricus 7036-1 на жидких питательных средах с различными источниками азотис-ого питания как

20 органического (кукурузный экстракт," соевая мука, рыбная мука), так и ми-. нерального происхождения (аммонийный и нитратный азот) и различными источниками углеводного питания (глюкоза, крахмал, глицерин), в различных сочетаниях рН 6,9-7,4 температура 26-28оC.

Из апробированных вариантов сред предпочтительна среда с кукурузным

30 экстрактом.

677497

Штамм Actinomyces tauricus 7036-1 характеризуется следующими культураль но-морфологическими и физиологобиохимическими свойствами.

Культурально-морфологические признаки.

Спороносцы спиральные, споры аваль ные, продолговатые, оболочка спор . гладкая. б

Минеральная среда Р 1 Гаузе. Воздушный мицелий бледно-роз овйй, розовый до ярко розового, субстратный мицелий бледно-лиловый до темно-малинового. Среда не окрашена, но с возрастом пигмент проникает в среду.

Среда Ср-1 Красильникова. Воздушный мицелий розовый, субстратный мицелий красный или малиновый, среда не окрашена.

Среда Чапека с сахарозой. Воздушный мицелий розовый, субстратный мицелий розовато-фиолетовый, среда не окрашена, Глюкозо-аспарагиновая среда, Воздушный мицелий отсутствует или сла. бо развит, розовый, субстратный мицелий розовато-фиолетовый, среда не окрашена.

Органическая среда 9 2 Гаузе.

Воздушный мицелий беловатый, розовато-белый, иногда отсутствует, субстратный мицелий от красновато-буроватого до буро"красного, среда окрашена от буроватого до коричневого цвета, среду окрашивают слабо.

Овсяный orap. Воздушный мицелий ярко-розовый, субстратный мицелий лиловый, среда не окрашена.

Физико-биохимические свойства. ,Отношение к источникам углеводов, Усваивает рамноэу, фруктоэу, ксилозу, рафинозу, арабинозу, хуже маннит.

Реакция на среде с пептоном и ли моннокислым железом положительная.

Антибиотик экстрагируют иэ мице- . лйя и нативиого раствора органическими растворителями. После упаривания растворителей получают продукт, который очищают хроматографированием и переосаждением из органических растворителей. Для хроматографии ис==ЪолЪзуют сййикагель марок Л 5/40 (ЛС 5/40р и Л 40/100/ . Отбирают фракции, содержащие тавримицин A u тавримицин В. Повторно хроматогра- фируют этй фракции в тонком слое силикагеля (марки Л 5/40р и ЛС 5/40р до получения хроматографически однородных веществ.

Мндивидуальность тавримицинов A и В подтверждена методом тонкослойной хроматографии в системах растворителей: 1) хлороформ и метанол

9:1 f тавримицин А к 0,17; тавримицин В R(0,4 (силикатель Л 5/40р):.

2. Метанол, СНС1э и ацетон 2:ll:1; . тавримицин A R< 0,37; тавримицин В

R 0,58 (силикагель ЛС 5/40, закрепленный слой, фосфатно-цитратный . буфер c pH 7), проявление при днев= ном свете по оранжево-красной окраске, в УФ-свете по оранжевой флоуресценции или парами 3 .

Пример 1. Культурой Actinomyces tauricus 7036-1 с агариэованной среды Гауэе-1 засевают маточные колбы Эрленмейера, содержащие 125 мл ферментационной среды следующего состава, Ъг кукурузный экстракт 0,5

40 .(по техническому весу); сернокислый аммоний 0,35, глюкоза 1,0 крахмал

1„„5, хлористый натрий 0,5, углекислый кальций 0,5; РН 6,9-7,0. Инкубируют при 27-28оС 48 ч на поступательной качалке со скоростью вращения 230-250 об/мин.

Глубинным мицелием засевают пар-. тию колб с той же средой и выращивают 96 ч. Получежную культуральную жидкость с активностью 1:1600 ед .

20 разведения используют для выделения тавримицинов A и В;

Пример 2. Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 на среде A-4 состава, г: coeg5 вая мука 10, глюкоза 10, хлористый натрий 5, углекислый кальций 2,5;

РН 7,2.-7,4. Активность культуральной жидкости 1:400 ед. разведения °

Пример 3. Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеРУ 1 на среде с глицерином состава, Ъ: глицерин 2, соевая мука 0,5, сульфат аммония 0,15, углекислый кальций 0,3, хлористый натрий 0,3, Активность культуральной жидкости

1:200 ед. разведения.

Пример 4. От 4,5 л глубинной культуры, полученной по примеру 1,. отделяют 0,6 кг мицелия. Антибиотики извлекают из мицелия 1,8 л

4© ацетона, Экстракт упаривают в вакууме до 300 мл, выпавший из водного остатка аморфный осадок отделяют и высушивают над хлористым кальцием.

Вес аморфного красно-фиолетовоге ц порошка 1,1 г.

Из водного маточного раствора, оставшегося после отделения осадка, антибиотики извлекают этилацетатом.

Экстракт высушивают, упаривают. По р лучают дополнительно 2,5 г маслообраз ного продукта, содержащего смесь антибиотиков.

2,0 r неочищенной смеси антибиотиков, полученной иэ мицелия, раство-. ряют в. хлороформе и вносят в колонку с силикагелем (марки Л 40/100р )

d = --3 см, В 28 см. Колонку промы;вают хлороформом, при этом вместе с жиром вымывают g и 3, - пирромицинойы (молекулярная масса 392 и 412

66 соответственно). Затем комплекс антрациклинов элюируют смесью СНС1 и метанола 9:1, контролем служит красно-оранжевая окраска элюата. Растворители упаривают, получают 0,24 г

Я маслообразного красного продукта.

677497 левых клеток человека (He 1 а) проявляется в койцентрации 0,5 мкг/мл (см, табл. 1) .

Таблица 1

Тавримицин A

0,1

0,5

1,0

100

Тавримицин Б

0,1

0,5

1,0

100

В опытах ln vlvo для тавримицина

А установлена выраженная активность в отношении, опухоли Эрлиха (асцитовый вариант), препарат вводят в течение 9 дней, начиная с 24 ч после заражения (см-. табл. 2).

Таблица 2

0,5

100

1,0

Как видно из табл. 2 при многократном внутрибрюшинном введении дозы 0,5 мг/кг антибиотик тормозит раэжитие опужоли на 95%.

Предлагаемый антибиотик обладает выраженной противоопухалевой актив ностью и является эффективным в отношении ряда форм злокачественных новообразований, не поддающихся лечению имеющимися химико-терапевтическими средствами.

Формула изобретения

1. Атибиотик тавримицин бруттоформулы

С4„Н„О, И„ где и,51 - тавримяцин A и п 49 тавримицкн В. Молекулярная масса тавримицина А 813, тавримицина В 18

Максимуьы поглощения в УФ-спектре (в спиртовом растворе) при 235, 257, 292, 466, 482, 494, 515 и 527 нм.

Полосы поглощения в ИК-спектре (в КВ -диска): 3450, 2945, 2870, 1640, 1610 сьев

его повторно хроматографируют на колонке с силикагелем, растворяютI в минимальном объеме хлороформа и осаждают десятикратным объембм гексана. Получают 0,1 г комплекса антрациклиновых антибиотиков: цинеру,бинов A и В и тавримицинов A и В.

Комплекс антарациклинов хроматографируют на колонке с силикагелем в системе метанол, СНС1 и ацетон

2:11:1, отбирают фракции, обогащей- ц ные одним иэ четырех антибиотиков (контроль — тонкослойная хроматография) и повторно хроматографируют эти фракции в тонком слое силикагеля (марки Л 5/40) и ЛС 5/40р до получения хроматографически однородных веществ.

Гидролиз цинерубина A. 30 мг антибиотика и 5 мл 0,1н . соляной кислоты кипятят с обратным хлодильником

30 мин. При этом из раствора выпада- 20 ет продукт красного цвета, который после охлаждения отделяют, промывают водой, высушивают и кристаллизуют из бензола. Красные иглы агликона имеют т.пл. 213-215 С (c разложением) g$ мол.в.428(масс-спектрометр КВ-90000, Швеция), в его УФ-спектре имеются те же максимумы, что и в спектре антибиотика (E -пирромицинон).

Агликоны из цинирубина В, таври- И1 мицина A и В получены аналогично и до идентифицированы сЯ вЂ” пирромицийоном по температуре плавления, УФ- и массспектрам, хроматографической подвижности в системах растворителей: 1) хлороформ и метанол 9:1, R< 0,44 (силикагель Л 5/40 P ) .

2) Метанол, хлороформ и ацетон

2:ll:1 Rg = 0,9 (силикагель ЛС 5/40)и) закрепленный слой, фосфатно-цитратный буфер с рн 7). 4©

3) Бензол и ацетон 6:l, Н 0,3 (эакрепленный слой ).

Вьдный раствор сахаров, полученный после отделения агликона, проявляется анилинфталатом на .круговой бумажной матограмме (системе бензол, пиридин, уксусная кислота и вода

15:10:3:12 в виде трех полос, одна из которых может, кроме того, проявляться нингидринсм (аминосахар). щ

Пример 5. Из 3,8 л нативного раствора, полученного в примере 4, антибиотики экстрагируют бутанолом.

Экстракт сушат Na

Пример 6, Смесь антибиотиков, полученную из нативного раствора по примеру 5, очищают как в примере 4. Получают 12 мг антрациклинового комплекса. Ж

Противоопухолевое действие тавримицинов обусловлено их антрациклино- вой природой.

Выраженный цитотоксический эффект тавримицина А и В в отношении опухо- 43

677497

Составитель Г. Смирнова

Техред М. Голинка КорректоР В. Бутяга

Редактор П. Горькова.Эаказ 5873/47

Тираж 528 Подписное

ВЧИИПИ Государственногб комитета СССР пэ делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Порошок оранжевого цвета, растворим в хлороформе, диметилформамиде, этилацетате, спирте, метаноле, водных растворах кислот и щелочей, ацетоне. Не растворим в воде, серном и петролейном эфирах, гексане.

Разбавленный раствор антибиотика в нейтральной среде окрашен в оранжевый цвет, при подщелачивании становится фиолетовым.

Глюкозид гидролизуется соляной, кислотой,-образуя агликон и три сахара.

2. Способ получения антибиотика по п. 1, отличающийся тем,что штамм Actinomyces tauricus

7036-1 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, выделяют целевой продукт и при необходимости разделяют на тавримицин A и тавримицин В.