Способ хроматографической очистки ферментов и других высокомолекулярных веществ

Способ хроматографической очистки ферментов и других высокомолекулярных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСЛНИ6

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ..АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Colas Соватскии

Сецнал исти ческим

Республик

< п679588 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (51)М. Кл.2 (22) Заявлено 271277 (21) 2560843/23-04

С 07 G 7/02 с присоединением заявки йо(23) ПриоритетГосударственный комитет

СССР по делим нзобретеннй н открытий (53) УДК 577. 15. .07 (088.8) Опубликована 1508.79 Бюллетень М 30

Дата опубликования описания 20 ° 08. 79 (72) Авторы изобретения

В. И. Максимов, А. К. Хасирджева и Г. A. Молодова (71) Заявитель Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТОВ

И ДРУГИХ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕЩЕСТВ

Целью способа является интенсификация процессов очистки и улучшение технологичности операций путем создания режима работы на укрупненных колонках, обеспечивающего многократИзобретение относится к области биотехнологии, и в частности к способам хроматографической очистки ферментов и других высокомолекулярных веществ. Способ может быть использован в производстве очищенных ферментов и других высокомолекулярных веществ из микроорганизмов и других источников. Он решает задачу многократного использования хроматографических колонок без выгрузки иэ них носителя, в частности геля, для получения очищенных высокомолекулярных веществ.

Известен способ хроматографическрй очистки высокомолекулярных веществ с использованием колонок с деформируемыми гелями, в которых раствор вещества и элюирующий раствор вводят либо сверху, либо снизу, принудительно (насосом) или под действием давления воды в питающем резервуаре, при котором первыми иэ колонки. выходят высокомолекулярные вещества, а потом в том же направлении вымываются низкомолекулярные примеси, при которых необходимо соблюдать условия низкого гидростатического давления (от 20 до 40 см вод.ст.) на гель илн низких скоростей протока (1).

Известен также способ хроматографической очистки высокомолекулярных веществ путем подачи их растворов под давлением снизу вверх в колонку с уплотняющимся носителем (например, гелем) со скоростью, не превышающей скорость естественного протекания.

При этом движение жидкости по колонке осуществляется либо принудительно (насосом), либо за счет гидростатического давления ° Вымывание высокомолекулярного вещества и примесей ведут в одном направлении и одним элюирующим раствором в количестве .превышающем один объем колонки (2).

Недостатком известного способа является низкая производительность и эффективность использования хроматографической колонки из-за возникающих уплотнений в геле, закупорки колонок, необходимость использования растворов вещества с низкими концентрациями, невозможность многократного использования укрупненных колонок.

579588 ное использование колонок без перенабивки носителем.

Указанная цель достигается за счет того, что осуществляют нагнетание раствора высокомолекулярного вещества снизу колонки с уплотняк цимся носителем с одновременным отсасыванием сверху с той же скоростью,высокомолекулярные вещества .вымывают водой. объемом в пределах 40-50% от полного объема колонки со скоростью подачи его, в два раза превышающей скорость подачи раствора высокомолекулярного вещества в колонку, и вымывание примесей. ведут 0,5-1,5 об. 0,1-1,0 М раствора уксусной кислоты, причем подачу раствора уксусной кислоты ведут снизу вверх через колонку, поставленную в положении, обратном к ее первоначальному рабочему положению.

Колонку, представляющую собой круглый цилиндр с пористыми дном и крышкой, наполняют деформируемым гелем, например акрилексом Р2, Р=б, P.=160 и другими. Раствор высокомолекулярных веществ, например ферментов, содержащий ниэкомолекулярные примеси, например соли, углеводы и др., концентрация которых достигает 530%, принудительно вводят в нижнюю часть колонки и одновременно принудительно выводят жидкость иэ верхней части колонки (с помощью насоса).

Далее вещество элюируют с колонки элюирующим раствором, водой, со скоростью, в 2 раза превышающей скорость введения раствора высокомолекулярного вещества в колонку. После выхода высокомолекулярного вещества для вымывания примесей меняют положение колонки таким образом, что ее верхняя часть оказывается в нижнем положении и соответственно нижняя часть наверху. В колонку снизу вводят принудительно другой элюирующий раствор — 0,1-1,0 М водный раствор уксусной кислоты (предпочтительно

0,5-1,0 М) в количестве 0,5-1,5 об. колонки. После этого повторно меняют положение колонки и ставят ее в исходное положение. Колонка готова для повторной процедуры очистки, Всего на колонке с диаметром 5 см и высотой 1.м и гелем акрилекс Р-6 удается провести не менее 10 хроматографических процедур, не разбирая колонки и йе извлекая гель иэ нее.

П P и м е р. Для хроматографической очистки используют колонку типа

К 50 (фирмы Фармация, Швеция) с внутренним диаметром 5 см и высотой . заполнения геля окло 1 м. Колонку заполняют гелем акрилекс Р-б, уравновешенным водой. Перед работой через колонку с гелем Р-6 пропускают воду в течение 5-7 ч со скоростью 180 мл/ч для уравновешивания геля в токе воды.

Воду подают и отсасывают насосом (тип Р-340, Польша) через два канала, обеспечивающих одновременное принудительное нагнетание воды в нижнюю часть колонки и ее отсасывание из верхней части колонки с одинаковой скоростью. После такого легкого сжа5 тия геля (на 2-5%) .в колонку вносят дополнительную порцию геля (2-5%) для доведения высоты слоя до первоначального уровня (около 1 м) и закрываюТ колонку крышкой. В соответст10 вии с конструкцией колонки на обоих концах (крышках) колонки нахрдятся фильтры, через которые можно подавать жидкость в колонку или собирать ее из колонки

Приготовление образца.

1 кг целлокандина ГЭх обрабатывают 2,5 л воды, смесь размельчают и оставляют на ночь при 4-8 С, после чего центрифугированием (3000 об/мин, 45 мин) отделяют надосадочную жидкость, содержащую смесь ферментов (1,2 л). К этому раствору добавляют

564 r сульфата аммония, выпавший осадок ферментов отделяют центрифугированием и растворяют в воде. (400 мл), получают 550 мл раствора, имеющего густую черную окраску.

Вымывание высокомолекулярных ве30

В нижнюю часть колонки с помощью насоса вводят 200 мл раствора, что составляет 10% от ее. полного объема со скоростью 60 мл/ч, после чего с

35 той же скоростью вводят в колонку еще 50 мп воды. Далее скорость введения воды увеличивают в 2 раза, т,е. доводят до 120 мл/ч. Вещество начинает выходить из колонки с объемом

500 мл, включая объем нанесенного ве40 щества. Выход вещества регистрируют по УФ-поглощению на длине волны около 280 нм с помощью увикорда (ДКБ, Швеция). Собирают фракцию до 320 мл., Она содержит более 80% ферментатив45 ной активности и менее 3-5% пигмента в расчете на 200 мл внесенного на колонку раствора. Соли и другие ниэкомолекулярные примеси вместе со значительной частью пигментов остаются

5р в колонке, Колонка к концу опыта сжимается (уплотняется) на 4 см по высоте, т.е. на 4%.

Вымывание примесей.

55 Для вымывания примесей колонку ставят в положение, обратное первоначальному рабочему. Элюирующий раствор (1 М СНЗСООН) вводят в нижнюю часть колонки, иэ которой выходил

60 раствор с веществом, когда она стояла в первоначальном рабочем положении. Для промывки используют 1,5 л уксусной кислоты. После кислоты вводят в колонку воду са скоростью более 100 мл/ч, количество воды составляет 3,5 л. б 79588

Формула изобретения

Составитель A. Бочаров

Редактор Ноаоиилоаа Текред И. Аоталсиа Корректор В. Бутика

Заказ 4738/23 Тираж 513 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул. Проектная, 4

Способ хроматографической очистки ферментов и других высокомолекулярных веществ путем подачи их растворов под давлением снизу вверх в колонку с уплотняющимся носителем и вымывании высокомолекулярных веществ и примесей, о т л и ч а ющ и Я с .я тем, что, с целью интенсификации процесса очистки и улучшения его технологичности, осуществляют нагнетание раствора высокомолекулярного вещества снизу колонки с одновременным отсасыванием сверху с той же скоростью, высокомолекулярные вещества вымывают:водой объемом в пределах 40-50 об.% (от полного ос ема колонки) со скоростью подачи его, в два раза превышающей скорость подачи раствора высокомолекулярного вещества в колонку, а вымывание примесей ведут 0,5-1,5 об. 0,1-1,0 М раствора уксусной кислоты, причем пода5 чу раствора уксусной кислоты ведут снизу вверх через колонку, поставленную в положении, обратном к ее первоначальному рабочему положению. р Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Sephadex Gel filtration in

theory and practice, 1976, проспект фирмы Pharmacia .

2. Детерман Г. Гель — хроматография, Мир, 1970, с. 55-84.