Способ определения перекиси водорода
Патент 680635
Авторы
Способ определения перекиси водорода
Иллюстрации
Реферат
° ептИО т
ОП ИСАНИ Е i680635
Союз Советскки
Социалистических
Республик
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (6l) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 15,1275 (21) 2301651/23-26 (23) Приоритет — (32) 21.12. 74 (3() P 2460903.8 (33) ФРГ
Опубликовано15. 08. 79.Бюллетень №30 (51) М. Кл.
С 01 В 15/02
G 01 N 21/06
Государствен ни и ком итет
СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК543-4. 05
:661.491 ,(088,8) Дата опубликования описания 25.08.79
Иностранцы
Вернер Гютляйн, Вальтер Риттерсдорф, Хуго Тидеманн, Петер Фогель и Вольфганг Вернер (ФРГ) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма Берингер Маннхайм ГМБХ (ФРГ) (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА
25
Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам обнаружения и определения перекиси водорода или соединений, при вступлении в реакцию которых образуется перекись водорода.
Реакция перекиси водорода с инди- каторами окисления при катализе благодаря пероксидазе или веществам, действующим как пероксидаза, играет особую роль в аналитической химии для красящих соединений, благодаря которой помимо обнаружения перекиси водорода и пероксидаз определяется также ряд веществ, реагирующих с кислородом и оксидазой с образованием перекиси водорода. Далее в качестве примеров перечислены некоторые .иэ этих веществ, в скобах приведены соответствующие им оксидазы: глюкоза (глюкозаоксидаза, галактоза, галактозаоксидаза), L — àìèíoêèñëîòà (L-аминокислотаоксидаза), холестерин (холестериноксидаза) и мочевая кислота (урикаэа). Это прежде всего вещества, обнаружение и определение которых имеет большое значение в медицинской диагностике и пищевой промышленности.
Поскольку эта реакция имеет большое значение в медицинской ускоренной диагностике, почти для всех названных реакций важное значение имеют так называемые экспресс-пробы, благодаря которым можно определить количественно и качественно отдельные компоненты реакции.
Известны индикаторы окисления для этих экспресс-проб. Известен ñïîñîá обнаружения и определения перекиси водорода с применением в качестве индикатора солянокислого бенэидина (1) .
Однако известный индикатор обладает недостаточными чувствительностью и стабильностью.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ обнаружения и определения перекиси водорода с применением в качестве индикаторов окисления соединений ряда бенэидинов, а именно о -толидинов (2).
Несмотря на широкое распространение этих индикаторов, О -толидины имеют свои недостатки.
Так, компоненты в рецептурах для экспресс-проб не всегда содержатся в оптимальных количествах, что приво3 68063 дит к появлению нежелательных окрашиваний и потере чувствительности при длительном хранении. Кроме того, катион радикала зелено-голубого цвета, образующийся при вступлении в реакцию с индикатором, не очень стабилен, так как при дальнейшем окис лении относительно легко переходит в хинодиимин коричневого цвета. Поэтому окраска анализируемых проб вследствие образования коричневого оттенка имеет нечистый тон, который быстро меняется и поэтому уже через непродолжительное время его нельзя правильно оценить. Хотя катион радикала может быть стабилизирован в значительном",объеме анионными смачивателями, последние не всегда применимы, так как они могут разрушать оксидазы уже на первой стации реакции
Целью изобретения является получение экспресс-проб, которые имели бы устойчивые радикалы кра= ÿùèõ веществ.
Поставленная цель достигается описываемым способом определения перекиси водорода, включающем образова4 25 ние окрашенного соединения с применением в качестве индикаторов окисления 3,3,5,5 -тетраалкилбензидинов
/ общей формулы
ЗО ъЦ1;
/ З где R<,R»R»R4 — одинаковые или раз- 3
35 ные радикалы, представляющие собой простые или разветвленные цепи низших алкильных групп с 1-6, предпочтительно с 1-4 атомами углерода.
Отличие способа состоит в приме- 4О нении 3,3,5,5 -тетраалкилбензидинов общей формулы, в качестве индикаторов окисления в экспресс-пробах для обнаружения и определения перекиси водорода, соединений, котсрые взаимодействуют с образованием перекиси водорода и соединений, ведущих себя, как перекиси.
Способы получения соединений формулы ; известны. 5О
Не описанные в литературе соединения, 3,3 -диметил-5,5 -диэтилбен! зидин и 3, 3, 5, 5 -тетраизопропилбензидин могут быть получены из О-толидина и этилена или бензидина и пропилена.
По изобретению тетраалкилбензидины могут быть применены для обнаружения глюкозы и крови в моче, холестерина в сыворотке, перекиси водорода в молоке или в пленках для проб для определения глюкозы в крови и сыворотке и во многих других пробах.
Все эти пробы отличаются тем, что цветные. реакции ярче, стабильнее и лучше оттенены, чем при применении 65
0,5 r
5 4 о-то"..идина, так как окраска катионов радикала тетраалкилбензидинов от зелено-голубой до зеленой не загрязняется примесью коричневых хинондииминов. В экспресс-пробах, описанных в примерах, четко проявляются свойства тетраалкилбензидинов, причем у отдельных представителей этих соединений наблюдается по сравнению с 0-толидином повышенная стойкость, например, при хранении индикаторной бумаги для обнаружения крови в моче.
Благодаря повышенной стабильности катионов радикалов в пробных пленках при определении глюкозы анализ возможен в достаточно большой промежуток времени.
Пример 1. Пробная бумага для обнаружения крови в моче, Фильтровальную бумагу (Шляйхер и
Июль Р 23ЯЬ) последовательно пропитывают в растворах 1 и 2 и высушивают при 40ОC.
Раствор 1.
1,2 М буферный раствор цитрата (pB 5, 25) 35,0 мл
Этилендиаминовая уксусная кислота, динатриевая соль 0,1 r
Диоктилнатрийсульфосукцинат
2,5-Диметилгексан-2,5-дигидроокись (70%-ная) 1,6 r
Триморфолид фосфорной кислоты . 12,7 r
Этанол 30,0 мл
Дистиллированная вода До 100 мл
Раствор 2.
3,3,5,5 -тетраметилбензидин 0,3 r
Фенантридин 0,2 r
Толуол До 100 мл
Для пробы применяют белую бумагу, которая окрашивается в зелено-голубой цвет при погружении в мочу, содержащую кровь, спустя 5-20 с. Если эритроциты в норме., то бумага окрашивается в зелено-голубой цвет. Если происходит гемолиз или в моче находится гемоглобин, то бумага тотчас же окрашивается также в зелено-голу-. бой цвет. Чувствительность 5 эритроцитов/мм или соответствующего количества гемоглобина. Количество эритроцитов ниже нормы также может вызвать при известных условиях появление отдельных зелено-голубых точек на пробной бумаге, Чувствительность по миоглобину соответствует чувствительности по гемоглобину.
После. трехдневной выдержки при 60 С пробные бумажки окрашиваются в желтоватый цвет, их чувствительность в основном остается прежней, а стремя реакции увеличивается на 60-90 с.
Пробная бумага, пропитанная о -толидином, после такой же выдержки, как при пропитке тетраметилбензидином, 5 6806 окрашивается в желто-коричневый цвет, ее чувствительность 20 эритроцитов/ щ
Пример 2. Бумага для проб 10 для обнаружения глюкозы в моче.
Фильтровальную бумагу (Шляйхер и
Шюль 597НГ) пропитывают в растворах
1 и 2 и сушат при 50 С. 15
Раствор 1.
Глюкозаоксидаза (70 об/мг) 222 мг
Пероксидаза (70 об/мг) 28 мг
Морфолиноэтансульфанат-буффер (рН 6!1!ОМ) 50 мл .
Татразин 80 мг
Поливинилпирролидин 300 мг дистиллированная вода до 100 мл
Желтый
Желтый
Желтый
Светло-зеленый Светло-зеленый Светло-зеленый
Зелено-голубой Средне-зеленый
100
Зеленый
Зелено-голубой
Зеленый
Голубоватозеленый
250
Голубоватозеленый
Черно-голубой Темно-зеленый
500
Густой зеленый.
Черно-оливковый Черный
1000
Пример 4. Бумага для проб для обнаружения холестернна и сложных эфиров холестерина в сыворотке.
Фильтровальную бумагу (Шляйхер и
Шюль 597МР, Инд) пропитывают растворами в определенной последовательности и высушивают при температуре 40 С.
225 мг
ЬО
175 мг
50 мг
150 мг
Бумаги такой же чувствительности и стабильности, которые взаимодействуют медленнее и дают чисто-зеленый цвет, получают при применении эквимолярных количеств 3,3,5,5!-тетраэтил.-3,3 -диметил 5,5 -диэтил- или
3,3,5,5 -тетраизопропиленбензидиноВ.
Бумажки для проб, которые содержат эквимолярные количества 3,3- диметил-5,5 -диэтилбензидина по устойчивости цвета практически не отличаются от бумажек, пропитанных тетраэтилбенэидином.
Пример 3. Бумажки для проб для обнаружения перекиси водорода.
Фильтровальную бумагу пропитывают в растворах 1 и 2 и высушивают при
40 С.
Раствор 1.
Тринатрийцитрат, дигидрат
Лимонная кислота, моногидрат
Пероксидаза (70 об/мг)
Альгинат натрия
Полиоксиэтиленсорбятанмонолаурат (твин) 1300 мг Ь5
Раствор 2.
3,3,5,5 -тетраметилбензидин 600 мг
Этанол До 100 мл
Бумажки для проб, которые содержат эквимолярные количества 3,3,5,5-!
-тетраэтилбензидина или О-толидина, получают по методике примера 1. Цвета реакций этих бумажек в моче, содержащей глюкозу, через 60-120 с после погружения приведены в таблице.
При применении тетраметилбензидина эти цвета не изменяются 10-15 мин, при сушке они приобретают более голубоватый оттенок и остаются такими в течение всего дня. L
Цвет пробной бумаги, пропитанной тетраэтилбензидином, при сушке слегка бледнеет, и остается таким не(сколько дней, Пробная бумага, npor!Mтанная.О-толидином, через 5-10 мин желтеет и бледнеет, а после сушки в течение 2-4 ч после концентрации глюкозы совершенно бледнеет или окрашивается в слабый коричнево-оливковый цвет.
Винилпирролидин-винилацетат-Иишполимеризат - 375 мг Дистиллированная вода До 100 мл
Раствор 2, 3,3,5,5 -тетраметилбензидин 500 мг
Ацетон До 100 мл
Так, приготовленная бумага для проб с перекисью водорода дает в водных растворах, например молоке, зелено-голубые цветовые реакции при концентрациях менее 0,1 мг %.
0,1 r
Формула изобретения
ЦНИИПИ Заказ 4681/57 Тираж 591 Подписное
Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул.Проектная, 4
Раствор 1, 1 М буферный раствор цитрата (pH 7), 20,0 мл
Холестериноксидаза (60 об/мг)
Холестеринэстераза (18 об/мг) 0,25 г
Пероксидаза (70 об/мг) 0,05 r
Дистиллированная вода До 100,0 мл
Раствор 2.
3,3,5 5 тетраметилбензидин 0,28 г
Эфир полиэтиленоктилфенола (Тритон х 100) 0,5 r
Метиленхлорид. До 100 мл
Таким образом, бумаги для проб реагируют с сывороткой, которая содержит холестерин и/или эфир холестерина, с образованием зеленых тонов, соответствующим интенсивности концентрации холестерина. Соответствующие пробные бумажки, которые содержат вместо тетраметилбенэидина О -толидин, взаимодействуют также с образованием зеленых тонов, однако они менее интенсивны, Пример 5. Способ получения
3,3,5,5 -тетраиэопропилбенэидина. (I
Раствор 100 г 2,6-диизопропилани,лина в 1280 мл воды и 10 мл концентрированной соляной кислоты (уд. вес
1,18) нагревают до 90 С и быстро приливают в нагретый до 97 С раствор желеэосинеродистого калия (III) в
5100 мл воды и 143 г едкого натра. B связи с выделением синильной кислоты работы следует вести при хорошей вытяжке. Образующуюся красного цвета суспензию перемешивают 15 мин, охлаждают и экстрагируют эфиром (6 х х 300 мл) . Эфирные экстракты сушат над сульфатом натрия, отсасывают, упаривают. Получают 97 г азосоединения в виде красного масла. При хроматографическом разделении на колонке с силикагелем (высота 110 см, диаметр колонки 8 см) системой хлороформ-.лигроин, взятых в соотношении
1:4 (силикагеля 1,5 кг с диаметром частиц 0,05 — 0,2 ьм) получают 32,4 r кристаллов кирпично-красного цвета, т.пл, 134-136 С.
Азосоединение растворяют в 500 мл ледяной уксусной кислоты, загружают
150 r цинковой пыли и нагревают полчаса при температуре кипения, с обратным холодильником. Затем отсасывают избыток цинковой пыли, растворитель упаривают под вакуумом. Получают 17,5 r бесцветных кристаллов, которые перемешивают со 1 1 мл воды, 0635 8 приливают 150 мл 2н. едкого натра и трижды экстрагируют порциями, по
150 млг хлороформа. Получают 12 4 г неочищенного 3,3,5,5 -тетраиэопроt 1 пилбензидина. К нему добавляют 90 мл уксусного ангидрида, быстро доводят
5 до температуры кипения и избыток уксусного ангидрида отгоняют в ротационном испарителе. Полученный остаток растворяют в 20 мл иэопропанола, приливают 180 мл лигроина и отсасывают
)p образовавшиеся кристаллы. Полученное
М,И-диацетилпроиэводное перекристаллиэовывают иэ изопропанола-. лигроина (2:1) ° Получают 7,6 r бесцветных кристаллов с т.пл. 366 С, Для отщеп15 ления N-ацетильных групп их нагрева-. ют в смеси 180 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл-концентрированной соляной кислоты в автоклаве, в течение 6 ч при 130-140 С. Затем реакционный раствор упаривают, остаток обрабатывают 200 мл 2н. едкого натра и выделившееся основание экстрагируют хлороформом, 4 х 50 мл. Хлороформные экстракты сушат над сульфатом натрия., ртсасывают, упаривают. Получают 3,3,5,5 -тетраизопропилбензиI дин в виде коричневатого масла. Вйход 5,6 г (молекулярная масса 352) .
Дигидрохлорид (С 4Н N<. 2НСВ) плавится при 263-265С С (с раэл.), 30
Способ определения перекиси водорода или соединений, ведущих себя
35 как перекись водоРода, включающий образование окрашенного соединения при взаимодействии с индикатором окисления, отличающийся тем, что, с целью проведения экспресс-анализа, в качестве индикатора окисления используют 3,3,5,5 -тетраалкилбензидины общей формулы
45- Наг МН ) где Ra R2 R3tR4- одинаковые или разные радикалы, представляющие простые или разветвленные цепи алкильных групп с 1-4 атомами углерода.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. У. Шамб, Сеттерфилд Ч. Перекись водорода ., изд. И-ИЛстанной литературы, M., 1968, с, 455-457.
2. Кульберг Л., Матвеев JI., ЖПХ,9, 755, 1936 (прототип).