Способ получения антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грамположительных бактерий

Способ получения антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грамположительных бактерий

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ о>680657

Союз Соввтскик

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 280677(21) 2497858/28-13 (23) ПРиоРитет — (32) 2906,76 (31) 269 34/76 (33) Великобритания

Опубликовано 150879. Бюллетень,% 30

Дата опубликования описания 180879

С 12 D 9/00

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (Щ УДЦ 615.779.931 (088. 8) Иностранцы

Гермес Пагани, Франческо Паренти, Каролина Коронелли и Джорджо Тамони (Италия) (72) Авторы нзобретенвя

P1) Заявитель

Иностранная фирма Группо Лепетит С.п.A. т (Италия} (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА ОБЛАДАЮЩЕГО

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРОТИВ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства антибиотика, обладающего антибактериальным действием, Предлагаемый антибиотик новый и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Цель изобретения — получение нового антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грам- положительных бактерий.

Эта цель достигается тем, что штамм .йс11тiорЪпеь carve@or eneis С.Ь.S.

Р 305 76 выращивают в азробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выцелением целевого продукта.

Штамм ActinopEcines earvepar ens s

C. В.S. Р 30576 для получения нового антибиотика выделен из пробы грунта вблизи Sapvepar %Ис Ге (Индия) и депонирован в С.Ъ.S. (Central bureau

Уоо Ьсп1пзпче СсиСйигез — Qsteretraot 1- Ъа— о 1 Нидерланды под номером

A/13826. Культурально-морфологические признаки. Штамм легко культивируется на различных питательных средах. В овсяной муке-агаре колонии имеют диаметр 3-4 мм, неравномерные очертания и шероховатую поверхность.

Воздушный мицелий отсутствует. Спорангии образуются на различных агаровых средах, они равномерны и шероховаты, диаметр 13-20 мкм. Зооспоры очень подвижны, шаровидны, 1О иногда немного продолговаты и имеют диаметр 1,5-2 мкм.

Культуральные свойства. Солодоводрожжевой агар: обильный рост, морщинистая поверхность, от оранжевого до коричневого цвета (средняя часть колонии более темного цвета). Овсяный агар: скудный рост, тонкая структура, стекловидного до светлооранжевого цвета, спорангии. Глицерино-аспарагиновый агар: обильный рост, корковая поверхность, яркооранжевого цвета. Пирозиновый агар: умеренный рост, корковая поверхность, оранжевого цвета. Глюкозо-аспарагиновый агар: обильный рост, шероховатая поверхность, ярко-оранжевого цвета.

Картофельный агар. Умеренный рост морщинистая поверхность, от оранжевого до коричневого цвета, спорангии.

Stmotococcus haemo5jticus

5Ьфщйсоссць aol еоs

0,2

ЩоЬсоссиь pneumorHae

0,4

Снятое молоко-агар: обильный рост, морщинистая поверхность, от оранжевого до светло-коричневого цвета, пятнистые тени.

Агар Чапека: обильный рост, морщинистая поверхность, оранжевого цвета.

Картофель: скудный рост, морщинистая структура, темно-оранжевого цвета.

Желатина: скудный рост, светло-оранжевого цвета. физиолого-биохимические свойства. Усваивает Cs — арабинозу, ксилозу, Се-глюкозУ, фруктозу, манно.- 10 зу, маннит, инозит рамнозу,сахарову, лактозу.

Не усваивает рафиноэу,целлюлоэуф специальный салицин.

Гидролизует крахмал, казеин, малат кальция.

Сероводород образует, меланин не образует, реакция тирозиназы-отрицательная. Нитраты восстанавливает.

Лакмусовое молоко не коагулирует, но пептонизирует, разжижает желати- 20 ну. о

Оптимум роста при 30 С в течение

6-14 дней.

Для поЛучения нового антибиотика штамм культивируют при анаэробных условиях в водной питательной среде, содержащей усваиваемые источники углерода и азота, а также минеральные соли.

Ь

Обычно культивируют в качалочной колбе до тех пор,. пока не образуется соответствующее количество антибиотика, после чего культуру пересевают на ферментационную питательную среду в вибрационном ферментере. 35

После этого продолжают культивировать при 25-35 С при анаэробных условиях до тех пор, пока не образуется значительное количество антибиотика. Концентрацию антибиотика контролируют в ходе культивирования микробиологическим путем по методу диффузии в чашке.

После отфильтровывания мицелия антибиотик выделяют из фермента» ционного раствора известным путем, 45 как, например, экстракцией органическим растворителем, в котором растворяется антибиотик, но который не смешивается с водной средой. Экстракцию производят после доведения зна- 50 чения рН фильтрата до 2-4. При этом в качестве растворителей используют алканолы С,-Св, алкиловые С,-С4 эфиры низких алйфатических кислот или низкие галогенированные углеводоро- 55 ды. Растворитель выделяют иэ ферментационного раствора путем центрифугирования при высоких скоростях, концентрируют его до 1/200-1/400 пе1 оначального объема, охлаждают и выдер живают его до тех пор, пока не образуется осадок, который потом фильтруют. Он состоит из очень чистого антибиотика. Потом маточные растворы собирают и наливают в избыток инертного неполярного растворителя, как, 7

4 например, масло, чем получают.еще определенное количество сырого антибиотика. Сырой продукт растворяют в смеси метанола с ацетоном и потом осаждают,из раствора добавлением кислотной воды.

Обе фракции соединяют и очищают путем хроматографии на колонке хлороформом и метанолом в качестве системы растворителей.

Затем антибиотик перекристаллизовывают из метанола и этилацетата 1:1 °

Антибиотик показывает ln vitro u io ч1чЬ противобактериальную активность, особенно я иЬ"о,прежде всего против грам-положительных бактерий.

Ниже приведена минимальная ингибирующая концентрация (мик), мкг/мл, для различных штаммов

Staphg&coecus ао еие ЛТСС 6538 0,025 йарЬцРососсив aur"еы тоал 0,025

Streptococcus haemohjt cus С 203 0,0062

Dipfacoccus рявипопще УС41 О,Я0078"

МоьЬ.(с6оа реИтчгфепа Х&Ы3543 О, 012

QNP(a9lR3 фъВберЬсою Н31 С.Z.S. 0 р 2.

Кроме того, новый антибиотик превосходно действует in viva при вызванных экспериментально инфекциях в мышах. Значения ЭД6 антибиотика, обнаруженные при эксйериментально вызванных инфекциях Staphylococcus аэ еив, Streptococcus hoerwbgicus,ЖрВсоссм pneumo ac, сведены в нижеследующей таблице.

Новый антибиотик также активен против микроорганизмов, которые устойчивы к обычно употребляемым антибиотикам. Токсичность антибиотика очень низка (ЭДвв перорально или внутрибрюшинно у мышей 1000 мг/кг).

П р и м е p . Штамм ktinopLanes

sarveparensis С.В.S- 305 76 предварительно культивируют в питательной среде при значении рН 6-10 до тех пор, пока не образуется значительное количество антибиотика. Культуру выращивают в качалочной колбе на среде следующего состава, г/л:

Мясной экстракт 3,0

Триптон 5,0

Дрожжевой экстракт 5,0

Глюкоза 1i0

Растворимый крахмал 24,0

Карбонат кальция 4,0

Дистиллированная вода (мл) До 1000.

Потом колбы встряхивают в течение суток при 28-30 С, после чего

1 предварительных культур пересе680657 6 вают на вибрационные ферментеры, содержащие 10 л питательной среды следующего состава, . г

50 (кя) До 10.

Мясной экстракт

Пептон

Дрожжевой экстракт

Хлорид натрия

Соевая мука

Глюкоза

Карбонат кальция

Водопроводная вода

)О

IIoToN с размешиванием анаэробно инкубируют при 28-30 С. В определенных интервалах по методу диффузии в чашкеi микробиологически испытывают активность антибиотика с $ЬзрИц(ососщь а еие в качестве подопытного организма. Максимальная активность достигается после 3-4 дней.

Выделение и очистка антибиотика.

80 л ферментационной жилкости фильтруют 1%-ным Cta cet.(вес./об.) в качестве вспомогательного средства для фильтрования. Мицелий выбрасывают и после подкисления отфильтрованного раствора 10%ной соляной кислотой до рН 2,5 его экстрагируют два раза этилацетатом, количество которого соответствует приблизительно 50% объема раствора.

Органическую фазу отделяют от водной центрифугированием при высоких скоростях, сушат ее Na>SO концентрируют при 45-50 С при вакууме до

1/300 первоначального объема, и охлаждают до 0-10 С. 35

Сырой осадок собирают на фильтре, промывают значительным количеством этилацетата и сушат в вакууме при

45 С. Таким образом получают 1,140г антибиотика с полученной спектрофо- 40 тометрическим путем степенью чистоты

70%.

Остающиеся после фильтрации маточные растворы наливают в 20 об./ч. легкого масла и получают еще 2,550r 45 антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью частоты 20-25%. Это вещество суспендируют в незначительном количестве метанола и ацетона (9:1). Нерастворимые составные части отфильтровывают, после чего разбавляют водой. Размешиванием 10%ной Соляной кислотой значение рН раствора доводят до 2,5. Таким образом .полученный осадок собирают центрифугированием и растворяют в минимальном количестве бутанола при темпера- ° турах 45-50 С. Раствор концентрируют

О в вакууме до 1/5 первоначального объема и охлаждают до 4 С. Полученный осадок собирают и сушат в вакууме, полу- 60 чают(0,450 г) антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью чистоты 80%. Полученные продукты потом продолжают очищать. Для этого их растворяют в минимальном 65 количестве хлороформа и метанола (85: 15) и хроматографируют предварительно активированной при 100 С колонкой Silica — Geb å (1 г 1 об,/об. и промывают смесью хлороформа/метанола.

Элюирование и тонкослойную хроматографию фракций производят той .же самой смесью. По данным тонкослойной хроматографии собранные фракции концентрируют в вакууме до незначительного объема. После добавки диэтилового эфира образуется осадок, состоящий из антибиотика с полученной спектрофотометрическим путем степенью чистоты 95 %. Осадок растворяют в метаноле и этилацетате (1:1), нагревают до 45 С и фильтруют. После охлажО дения до 4 С и .выдерживания в течение ночи при той же самой температуре получают чистый антибиотик в виде светло-желтых игол, Химико-физические свойства антибиотика.

Антибиотик представляет собой порошок светло-желтого цвета, кристаллической структуры и кислотного характера. Анализ кислотного гидролизата антибиотика в 6 н.соляной кислоты в герметнчески запаянной трубке при 110 С показал 4 аминокислоты, три иэ которых в аминокислотном автоанализаторе были определены как аспарагиновая кислота, треонин и глицин. Точка плавления антибиотика 210ОC.

Элементарный анализ, %:

С 51,35у Н 5,05; N 10,50; S 11,05;

О (при помощи разности) 22,05.

В ультрафиолетовой области видимые спектры поглощения: (нм) 1%

El (см)

103 (плечо)

326 (плечо)

67 (плечо)

326

99 (плечо)

236.

Растворитель

237

7,5) 408

378

237

8,8) 408

238

0,1 н, НСЕ то же то же буфер О, 15 М (рН то же то же то же буфер 0,15 N(pH то же то же

Ультрафиолетовые спектры поглощения устанавливают с помощью ультрафиолетового спектрофотометра в растворах с буфером метилцеллозольва (1:1) при различных значениях рН.

Антибиотик содержит сильно флуоресцирующий хромофор. Раствор активированного при 240 нм продукта в

0,1 н растворе едкого натра показывает эмиссионный спектр с максимумами при 355 и 490 нм.

Спектр флуоресценции был установлен с помощью спектрофотометра флуоресценции. б 80657

Составитель С.Малютина

Техред Э.Чужик Корректср С. Шекмар

Редактор Н.Потапова

Заказ 4657/59 Тираж 526 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб.,д.4/5

Филиал ППП Патент, r.Óærîðoä, ул.Проектная,4

Характерные полосы поглощения в ньюеле были Установлены при следующих частотах (см г )г

3400 (плечо), 3350 (сильно), 3200 (плечо), 3100 (сильно), 2930 и 2870 (ньюель), 2800-2400, 2380 (атмосферная двуокись углерода), 1750 (сильно), 1670 (сильно), 1620 (сильно), 1540 (сильно), 1480 (сильно), 1460 и 1380 (ньюель), 1420 (сильно), 1340 (сильно), 1320 (сильно), 1280 (сильно), 1240 (сильно), 1195 (сильно), 1170 (сильно), 1145 (сильно), 1120 (сильно), 1075 (широко), 1015 (сильно), 990 (сильно), 935 (сильно), 920 (широко), 900 (сильно), 865 (сильно), 840 (сильно), 800 (сильно), 770 (сильно), 755 (сильно)

740 (сильно), 720 (ньюель) .

Инфракрасный спектр был установлен с помощью спектрофотометра.

Удельное вращениег (а ) = +125 (C=O 8% в метаноле и хлороформе 1:1) .

Соединение растворяется в диметилсульфоксиде, диметилформамиде и смесях хлороформа и метанола, мало растворяется в хлороформе, метаноле смесях метанола и зтилацетата, раст-ворах NaHCOs и ледяной уксусной кислоте, не растворяется в воде и остальных общепринятых органических растворителях.

Предлагаемый способ обеспечивает получение антибиотика, обладающего г0 антибактериальным действием против грам-положительных бактерий.

Формула изобретения г5

Способ пол)учения антибиотика, обладающего антибактериальным действием против грам-положительных бактерий, заключающийся в том, что штамм

Pctirep&nes ьснчерсгг еляков C.Â.s- Р 30576 выращивают в азробных условиях на ггитательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта.