Способ получения противоопухолевогоантибиотика

Способ получения противоопухолевогоантибиотика

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И -C- À Н И- E

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик («)681918

К АВТОРСКОМУ СВ ЕТВЛЬСТВУ (6! ) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 200178 (21) 2588743/28-13 с присоединением заявки Йо (23) Приоритет—

Опубликовано 070881 Бюллетень т4о 29 (51)М. Кл.3

С 12 D 9/14

Государственный комитет

СССР оо делам изобретений и открытий

И) НЖ 615. 779. 931 (088. 8) Дата опубликования описания Q7Q881

В.И. Фролова, A.Ä. Кузовков, М.М. Тайг, Л.П. Иваницкая, С.М.. Навашин, Т.Г. Терентьева, Б.В. Розынов, В.Е. Гринев и Э.М. Сингал (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО

АНТИБИОТИКА

Изобретение относится к микробио- логической промышленности и касается получения противоопухолевого антибиотика.

Предложенный антибиотик является новым и способ его получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение противоопухолевого антибиотика.

Эта цель достигается тем,что штамп

Actinomyces coerulescens 1072/76 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Противоопухолевый антибиотик 1072 представляет собой кристаллы желтого цвета с температурой плавления 251253 С, в состав которого входят два компонента с молекулярным весом

482+2 и 494 2 (масс-спектрометричес25 ки), Найдено, Вт С 63,01; 62,91;

Н 5,50; 5,65. (ac) 249,9 20о (с 0,133%, в ДМСО) . (x) 315,1+20о(с 0,011%, .в ледяЭ ной уксусной кислоте) . ЗО

Антибиотик 1072 растворим в диметилформамиде, диметилсульфоксиде, пиридине, трудно растворим (при нагревании) в метаноле, этаноле, бутаноле", бензоле, хлороформе, ацетоне, не растворяется в серном и петролейном эфирах, гексане, в воде, разбавленных водных растворазс кислот, в

10%-ном водном растворе едкого натра растворяется медленно с темнофиолетовым окрашиванием.

В УФ-спектре антибиотика (в метанольном растворе) наблюдаются максимумы поглощения при 245,266,275, 285,393 нм (E« 811, 548, 640, 503, 274 соответственно). В ИК-спектре (в КВе- диске) имеются полосы поглощения 3400 см (-ОН-группы),1685 см (-С-О-группа), 1620 см (-С=О-группа хинона, связанная водородными связями).

Характер УФ-спектра и наличие поглощения в области 1685 и 1620 см в ИК-спектре позволяют предположить, что частью структуры антибиотика

1072 является свободная хиноидная группировка и хиноидная группировка, связанная водородными связями.

В ЯМР- спектре силиловых эфиров антибиотика (в CC14) имеются сиг681918

Пример 1. Культурой Act.coeru1esceus 1072/76 с агариэованной среды Гаузе-1 засевают колбы Эрленмейра, содержащие 125 мл ферментацион$O ной среды следующего состава,Ъ: глю.коза 11 соя 1; NaC1 0,5; СаСО 0,25; рН 7,2-7,4. Инкубируют при 27-28оС

48 ч на поступательной качалке со скоростью вращения 230-250 об/мин.

Глубинным мицелием засевают партию колб с той же средой и выращивают

96 ч. Полученную культуральную жидкость с активностью 1:1280 ед. разведения используют для выделения анЩ тибиотика 1072.

Пример 2. Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 ,,на среде состава, 2:глицерин 20, соевая мука 5, сернокислый аммоний 1,5, Я ИаС1 3, мел 3. рН 6,8 — 7,0. Активналы четырех метоксильных групп, метильных групп, групп -СН О и четырнадцати ароматических протонов.

Противоопухолевая активность антибиотика 1072 in vivo изучалась в опытах на ьишах с перевиваемыми опухолями: асцитнымн (карцинома Эрлиха, лимфаденоз Фишера) и плотными (карцинома 755, саркома 180) . Способ введения — внутрибрюшинно в двух

1 режимах: с 1 по 9 день (1 — + 9) 9) и на 1,5 и 9 день (1,5,9) после заражения.

Противоопухолевая активность антибиотика 1072, введенного внутрибрюшинно, представлена в табл. 1.

Антибиотик 1072, примененный в цвух режимах,вызывал торможение асцитных опухолей на 100%; солидных опухолей на 40%(саркома 180) и бОЪ(карцинома 755).

Антибиотик 1072 характеризуется большой широтой химиотерапевтического действия: МПД для однократного введения больше однократной лечебной дозы в 50-250 раз.

Антибиотик 1072 активен по отношению к грамположительным бактериям, включая штампы, резистентные к антибиотикам, широко применяемым в медицинской практике (табл. 2).

Культурально-морфологическая и физиологическая характеристика культуры 1072/76 °

Минеральная среда 9 1 Гаузе.

Воздушный мицелий пушистый или бархатистый, бледно-голубой. Спороносцы спиральные, q 3-5 завиткЖчи.

Споры шаровидные, овальные с шиповидной оболочкой.

Субстратный мицелий бесцветный, среда не окрашена.

Крахмальный агар.

Рост хороший, воздушный мицелий пушистый, голубой. Субстратный мицелий бесцветный, среда не окрашена.

На синтетических средах наблюдается хороший рост, колонии и среды не окрашены.

Воздушный мицелий бархатистый, голубой.

Овсяный агар.

Воздушный мицелий хорошо развит, голубовато-серый, бархатистый, пушистый. Субстратный мицелий бурый, среду окрашивает в бурый цвет..

Соевая среда.

Воздушный мицелий пушистый, слабо развит, голубовато-серого цвета.

Субстратный мицелий буроватый, в среду проникает бурый пигмент.

Картофельный агар.

Воздушный мицелий голубой, Колонии в среде бесцветные.

Органическая среда 9 2 Гаузе.

Воздушный мицелий слабо развит, голубоватого цвета. Субстратный мицелий бурый, среду окрашивает в бурый цвет.

Физиологические свойства, Желатину разжимает медленно, молоко свертывает и пептониэирует.

Крахмал гидролизует, нитраты восстанавливает, сахарозу инвертирует.

На клетчатке не растет. Среда Траснера-Данга чернеет. Ассимилирует глюкозу, маноэу, сахарозу, инозит.

Не усваивает рамкозу, сорбит, мальтозу, инулин.

Антогонистическое действие в от-.. 0 ношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Получают антибиотик следующим образом.

Штамм Act. coerulescens 1072/76

15 выращивают на среде, содержащей основные источники углерода, азота и минеральные соли. Антибиотик экстрагируют из мицелия органическим растворителем, экстракт упаривают, 20 из полученного водного остатка антибиотик отделяют фильтрацией или извлекают органическим растворителем. После отгонки получают антибиотик 1072 в смеси с сопутствующими антибиотиками и неактивньмли примесями. Отделение от последних осуществляют хроматографированием, а также кристаллизацией из органических растворителей и их смесей.

Для хроматографии (в тонком слое

З0 и колоночной) используют силикагель марок ЛС 5/40)(1, Л /40 и, Л40/100)и и окись алюминия.

Хроматографическая однородность антибиотика установлена методом тон35 кослойной хроматографии в системах растворителей:

1. Метанол: СНС1 .. ацетон =2 .11:1

R 0,6, силикагель ЛС 5/40, закрепленнйй слой фосфатно-цитратный, буфер

4О с рН 7. 2. СНС1 : метонал-9:1. R О,З силикагель Л 5/40н. 3. Метанол:СЙС1 ацетон вЂ,2:11:1. Rc 0,6 (Ai O ), проявление при дневном свете по желтой окраске, в УФ-свете по жел45 той фЛуоресценции или парами 31 .

681918

Таблица 1

l,0

1 9 82

100

5,0

100

15 0

1,5,9 100

100

Таблица

Минимальная подав ляющая концентрац мкг/мл

Устойчивость

Тест-культура

К стрептомицину

1. Staphanreus

209-р

0,12

0,12 неомицину канаминцину гентамицину (0,06

0,12 ность культуральной жидкости l".20 ед. разведения.

Пример 3 ° Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 на среде состава, 2 : кукурузный экстракт 10, мел 5, сернокислый аммоний 3,5, NaC1 5, глюкоза 10, крахмал 15; рН 6,8-7,0. Активность культуральной жидкости 1:20 ед. разведения.

Н р и м е р 4. Процесс глубинного биосинтеза осуществляют по примеру 1 на среде состава: соевая мука 30, сернокислый аммоний 3, ИаС1 3, мел 7, крахмал 50, кобальт 0,3 мг/л, рН 6,9.

7,0. Активность культуральной жидкости 1:20 ед. разведения. 1

Пример 5. От 4,5 л глубинной культуры, полученной по примеру

1, отделяют мицелнй (0,4 кг). Из мицелия антибиотики извлекают экстракцией 1,2 л ацетона. Экстракт упа- щ ривают в вакууме до л 200 мл,,из полученного водного остатка антибиотики извлекают этилацетатом, при концентрировании этилацетатного экстракта получают кристаллический осадок в виде желтых или зеленоватожелтых игл, который отделяют и промывают этилацетатом. Вес воздушного сухого осадка 140 мг. После перекристаллизации из метанола и высушивания в вакууме при 100оС получают 85 мг желтых игл с т.пл. 2512530С, (а(.)в 249,9 (с 0,133%, в ДИСО), (d)> 315,1+ (с 0,011В в ледяной уксусной кислоте) .

Найдено, Ъг С 63, 01; 62,91; Н 5,56; 5,65.

В масс-спектре имеются два пика молекулярных ионов 482+2 и 494 2, в масс-спектре силиловых эфиров молекулярные пики 770 2 и 782 2, от-, вечающие молекулярным весам компонентов с четырьмя триметилсилильными группами.

Пример 6. Антибиотик экстрагируют из мицелия по примеру 5, экстракт упаривают до водного остатка, из которого антибиотик выпадает в виде желтого осадка. Осадок отделяют, высушивают (310 мг) и перикристаллизовывают из метанола или смеси растворителей метанол:СНС1, ..

:ацетон-2:ll l, Получают 138 мг антибиотика 1072.

Пример 7. Антибиотик экстрагируют из мицелия по примеру 5, экстракт упаривают до водного остатка и антибиотик извлекают этилацетатом. Органическую фазу упаривают досуха (1,5 г), растворяют в смеси

-сфганических растворителей н наносят на силикагель марки Л 40/100р, высушивают, вносят в колонку с силикагелем, которую сначала промывают хлороформом, затем элюируют системой метонол-CHC1>-.-ацетон-2:11:1.

Хроматографически однородные фракции объединяют, упаривают растворитель и кристаллизуют из метанола .Или смеси растворителей. Получают

74 мг антибиотика 1072.

Предлагаемый способ обеспечивает получение противоопухолевого антибиотика, обладающего широким спектром противоопухолевого действия, который может найти применение в меди" цине.

681918

Продолжение табл. 2

Минимальная подавляющая концентрация мкг/мл

Тест-культура

Устойчивость тетрациклину

0,12

696-стрептотрицину (0,06

О, 12 лннкомицину виомицину эритромицину

0 12

0i12 актиномицину

0,12 фузидину

452/7 новобиоцину рифамицину

2843

0,12 ванкомицину

0,12

0,49

) 500

500

5. Protens inlgaris

6. Klebsiella pneumonlal

250

500

7. Providensia

500

8. Commomona s

31,2

9. Candida

500

4$ rulescens 1072/76 выращивают на питательной среде, содержащей источ-, ники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением ii очисткой целевого продукта.

Формула изобретения

Способ получения противоопухолевого антибиотика, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что штамм Actinomyces coeСоставитель С. Малютина

Техред М. Голинка Корректор В. Бутяга

Редактор П . Горькова

Тираж 528 .,Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 Раушская наб., д. 4/5

Заказ 5873/47

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная 4

2. Вас.mycoides 537

3. Е.coli 675

4. Рвепйоаопав aeruginosa оО, 12 (О, 06

0 12

0,12