Способ приготовления питательной среды для выращивания плесневых грибков с целью получения пенициллина
Патент 68447
Авторы
Классы МПК
Способ приготовления питательной среды для выращивания плесневых грибков с целью получения пенициллина
Иллюстрации
Реферат
№ 68447
Класс 30h, 14
СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Л. М. Уткин
СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЪНОИ СРЕДЫ ДЛЯ
ВЫРАЩИВАНИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБКОЦ Q ЦЕЛЬЮ
ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНА
Заявлено 14 марта 1945 г. за № 4991/337152 в Народный Комиссариат здравоохранения СССР
Рецептура сред, применяемых для выращивания плесневых грибков, образующих пенициллин, весьма разнообразна. Известно, что в качестве питательного вещества вводят большей частью сгущенный экстракт, получаемый при замачивании зерен кукурузы и являющийся там весьма ден1евым о ходом промышленности, перерабатываюц1ей кукурузу. Кроме того, в состав среды входит также один из доступных углеводов, например молочный сахар, являющийся отходом сыроваренйой промышленности, или ба тр-коричневый песок, получаемыи кристаллизацйеи второго маточника при рафинировании тростникового сахара.
Рекомендованная ранее мясопептонная среда совершенно непригодна для производства как по причине ее дороговизны, так и потому, что высокая активность получаемой культуральной жидкости обусловлена главным образом наличием второго антнбиотического вещества нотатнна (оп же крустозин, пенициллин В или глюкозодегидрат), который еще не нашел себе практиче;"кого применения. (Выход пенициллина на этой среде невелик) .
Применяемая в настоящее время среда, приготовляемая из пшеничных отрубей, привлекательна своей доступностью и дешевизной, чо производственный опыт показывает, что получаемая с нею культуральная жидкость не всегда имеет высокую активность. Кроме того, извлечение пенициллина из этой культуральной жидкости сопряжено; известными затруднениями, которые вызывают необходимость эмульгировання прн применении экстракционного метода и неполного снятия пенициллина с адсорбата при адсорбционном методе. Синтетическая среда Чапек-вуокса с глюкозой и добавкой дрожжевого экстракта, применявшаяся в Англии в первый период работы над пенициллином, дает культуральную жидкость невы;"окой активности (3 — 4 оксф. ед. в 1 лл) и менее пригодна для получения пенициллина, чем мясопептонная среда.
¹ 68447
Определение активности дало следующие результаты:
Время (сутки) .. 5 7 9 11 13 15 17
Активность в оксф. ед.... 0,6 рН....... 53
Пример 2. Состав среды тот же, что и в примере 1.
2,5 5,0 25,0 25,0 24,0 20,0
5,7 6,8 7,0 7,8 8,3 8,5
Определение активности дало следующие результаты:
Время (сутки)
Активность в оксф. ед. рН....
4 6 8 11 1 3 16
16,5 10,0
8,6 9,1
2,0 8,0 22,5 23,0
5,4 6,7 7,5 8,5
Предлагается дрожжевой экстракт, под которым подразумевают отвар дрожжей заменить в синтетической среде Чапек-Докса дрожжевым автолизатором, т. е. раствором, содержащим продукты самопереваривания дрожжевых клеток. Полученная среда дает культуральную жидкость более высокой активно"ти, порядка 20 — 25 оксф. ед. в 1 мл и даже выше.
Переработка ее не представляет затруднений и грибок на этой среде не образует нотатина, независимо от того, содержит ли среда глюкозу или какой-либо другой углевод, так что вся активность культуральной жидкости обусловлена наличием в ней пенициллина.
Так как дрожжи являются доступным материалом и производство их можно вести на очень дешевом сырье (например, древесные гидролизаты), то среда с дрожжевым автолизатом не может встретить препятствий для ее применения. Углеводным компонентом среды могут служить глюкоза, отходы рафинадных заводов (бастр), молочный сахар, мальтоза в виде продуктов осахаривания крахмала солодом, или продукты кислотного гидролиза крахмала, начиная с декстринов.
Применяя гидролиз крахмала серной кислоты до стадии декстринов и нейтрализуя затем кислоту мелом или известью, удается значительно ускорить фильтрование дрожжевого автолизата. В этом случае по окончании гидролиза крахмала к гидролизату прибавляют готовый, но не фильтрованный автолизат дрожжей, после чего проводят нейтрализацию мелом. Выпадающий при этом сульфат кальция захватывает дрожжевые клетки, вследствие чего фильтрование ведется на нутче, причем оно идет очень быстро и осадок может быть промыт водой.
Пример 1. Приготовление автолизата. 250 г прессованных дрожжей размешивают с 1 л, водопроводной воды в равномерную суспензию, прибавляют 5 лл хлороформа и смесь оставляют в закрытой склянке при
37 — 40 на 2 суток, время от времени взбалтывая. По истечении указанного времени смесь нагревают до кипения и фильтруют на складчатых бумажных фильтрах. Фильтрат светло-желтый, опалесцирует рН-6,0 — 6,5.
В 500 я.г водопроводной воды растворены 40 г глюкозы, 3 г нитрата натрия, 1 г фосфата калия однозамещенного, 0,5 г сульфата магния и
0,5 а хлористого калия. Затем прибавляют 200 лл автолизата и смесь доводят водой до 1 л. Полученную среду Чапек-Докса с 20% автолизата разливают по коническим колбам слоем высотою 2 ся, колбы закрывают ватными пробками и стерилизуют 30 мин. при давлении в 1 атм. По охлаждении засеивают конидиями Penicillium crusiosum с агаровой кульо туры и помещают в термостат при 24 .
К 68447
Пример 3. Состав среды аналогичен примеру 1, но вместо глюкозы взято 4% молочного сахара. Определение активности дало следующие результаты.
Время (сутки)
Активность в оксф. ед. р 1-1 .
4 6 10 12 17 18 23
4,0 11,5 28,0 50,0 46,5 42,0 13
58 72 72 76 82 84 89
Пример 4. 10 г картофельного крахмала заливают 100 л л
2,5%-ной серной кислоты и смесь нагревают при помешивании. Сначала смесь сильно густеет, затем разжижается. Смесь кипятят 30 мин; реакция с йодом отрицательная. К горячему раствору прибавляют 50 лл автолизата (п. A.), но не фильтрованного, после чего тотчас нейтрализуют мелом. Осадок отсасывают на воронке Бюхнера и промывают водой два раза. Светло-желтый, опалесцирующпй фильтрат разбавляют водой до
250 лы и в нем растворяют соли Чапек-Докса в количествах, соответствующих 250 мл, затем следуют стерилизация и засев, как в примере 1.
Определение активности дало следующие результаты:
Время (сутки)
Активность в оксф. ед.
5 7 9 10 11 13
7,5 20,0 25У 28,0 25,0 20,0
Пример 5. 15 г картофельного крахмала и 150 я.г. 2,5%-ной серной кислоты нагревают как в примере 4, смесь кипятят 10 мин.; реакция с йолом красно-фиолетовая. В горячий раствор вливают 100 мл нефильтрованного автояизата, смесь нейтрализуют мелом, осадок отсасывают на воронке Бюхнера и промывают водой. Светло-желтый, опалесцирующий фильтрат разбавляют водой до 500 ял, в нем растворяют соли ЧапекДQKcB из расчета на 500 ял, затем следуют стерилизация и засев, как в примере 1.
Определение активности дало следующие результаты:
5 8 11 14
4,0 31,0 30.0 25,0
Предмет изобретения
Время (сутки)
Активность в оксф. ед.
1. Способ приготовления питательной среды для выращивания плесневых грибков с целью получения пенициллина с применением углеводов и минеральных солей среды Чапек-Докса, о тл и ч а ю шийся тем, что к указанным солям и углеводам добавляют автолизат прессованных или пивных дрожжей.
2. Прием выполнения способа по п. 1, отл и ч а ю щ ий с я тем, что крахмал гидролизуют серной кислотой до стадии декстринов или глюкозы, к полученному раствору добавляют нефильтрованный автолизат дрожжей, кислоту нейтрализуют мелом или известью, фильтруют и в фильтрат вводят минеральные соли среды Чапек-Докса.