Способ получения препарата иммобилизованной протеазы bacillus subtilis

Способ получения препарата иммобилизованной протеазы bacillus subtilis

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СО1ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИЛЛИСТИЧЕСКИХ РЕСП ВЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ав SU pl> 686 ЖЮ

{51) С12ИИ И А61К 7 48

1. (21) 02528785/04 (22) 05.09.77 (46) 1512Ю Боя. Йя 45-46 (71) Слециальиое конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ; Институт цитологии и генетики CO AH СССР (72) Аветисов ПА; Загребельный С.Н„Земцова Л3„

Кузмарева ТИ; Сглганик P.È„Ñòàðîñòèíà В,К (73) НМКТИ БАВ НПО "Вектор" (54) СИОССБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММОБИПИЗОВАННОЙ и РОТЕАЗЫ ВАСЫМ$

SU8TtUS (57) 686377

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к способам получения иммобилиэованных ферментных препаратов, а именно к способу получения препарата иммобилиэованной протеазы 5

„BaclI! us sub till s, Препарат иммобилизованной протеазы

Bacillus subtll может быть использован s медицийе для лечения гнойных абсцессов и ран,. в,.биохимии для гидролиэа белков в 10 . лабораторных",целях, а также в промышленности для гидролиза белковых смесей.

В литературе описан ряд способов получения иммобилизованных протеаз BBCIIIus

subtllls.,з 15

Известен способ получения препарата иммобилизованной субтилопептидаэы А

Вас. subtills на пара-аминобензилцеллюлозе, который включает две стадии: актива=. цию матрицы путем диазотирования и 20 иммобилизацию фермента на активированной матрице.

Недостатком способа является низкая протеолитическая активность и репаратов— менее 10Я, от исходной. 25

Известен также способ получения препарата иммобилиэованной протеазы Вас.

subtllls на силохроме С-ЯО, включающий активирование матрицы с помощью глутарового альдегида с последующей 30 иммобилизацией фермента. Источником протеаэы служит раствор протосубтилина Г

10 Х, представляющий собой сложную смесь белков, включающую фермент протеазу, полученную после осаждения балласт- 35 ных белков из культуральной жидкости

Bacillus зоЫИз ацетоном, центрифугирования и сублимационной сушки супернатанта.

Способ получения препаратов иммобилиэованной протеазы заключается в следую- 40 щем. Силохром С-80 обрабатывают аминопропилэтоксисиланом, а затем глутаровым альдегидом. К влажному активированному носителю добавляют 30 -ный раствор протосубтилина Г10Х в количестве 45

27-30 ед.flC/MÃ */ носителя, (3a единицу

ПС принимается такое количество фермента. которое в течение 1 ч при 38 С катализирует гидролиэ казвина в такой степени, что способность его связывать HCI падает на 50 величину, эквивалентную 1 мл 0,1 н раствора NaOH). Процесс иммобилизации осуществляют при перемешивании на ледяной бане при рН 7.4-7.5, После чего препарат отделяют на пористом фильтре от жидкости.

Иммобилиэованный препарат промывают до исчезновения следов белка в промывных водах. Процент сохранения активности препаратов составляет 12.9- 14,ь.

Недостатком этого способа является низкий процент сохранения активности и ограниченность применения. Так. например, получаемый препарат невозможно использовать вмедицине.

Целью описанного способа является устранение недостатков известного способа, а именно. увеличение процента сохранения активности протеаэы при иммобилизации, Указанная цель достигается за счет того, что в качестве матрицы для иммобилизации про вазы используют аминоэтилцеллюлозу (AE-целлюлозу), а активацию матрицы проводят в 0,1-1М фосфатном буфере при рН

6-9 в течение не менее 2 ч.

Согласно изобретению описывается способ получения препарата иммобилиэованной протеазы Вас. subtllis с высоким процентом сохранения активности, заключающийся в активации АЕ-целлюлозы глутаровым альдегидом в 0,1 — 1M фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч с последующей иммобилиэацией фермента на активированном носителе.

Процесс проводят следующим образом.

В качестве аминоэтилцеллюлоэы (АЭцеллюлоза) используют препарат отечественного производства (завод химреактивов в г. Олайне) и фирмы "Реанал" (Венгрия).

Протеазу Вас. subtills берут в виде водного раствора.

В качестве источника протеаз используют протосубтилин ГЗХ, очищенный по методу, который заключается в осаждении балластных белков раствором CaCIz, удалении осажденных белков центрифугированием и осаждении протеаз из надосадочной жидкости этиловым спиртом. За единицу активности протеаз принимают такое количество фермента, которое переводит в кислоторастворимую фракцию 1 мг тирозина за 15 мин при 37 С.

Описываемый способ состоит из следующих стадий: — активиравание ЯЭ-целлюлозы глутаровым альдегидом в 0,1-1 M калий-фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее

2 ч при комнатной температуре. при уменьшении времени активации снижается протеолитическая активность конечного продукта. — иммобилизация протеазы на активированной АЭ-целлюлозе при 4-5 С и перемешивании в 0,1 — 1 M растворе калий-фосфатного буферэ рН 7,3-7,7.

Вносят 40-50 ед. акт. фермента на 1 кг сухого веса активированной матрицы.

При уменьшении конценграции фосфорнокислых сопей в буфере п 1и активации й86377

Составитель Л.Аветисов

Техред М.Моргентал Корректор Л.Пилипенко

Редактор А,Колоскова

Заказ 3348

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-.издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 и иммобилизации снижается активность конечного продукта.

Полученные препараты иммобилизованной протеазы имеют активность 32-40 ед,акт,/г сух. и репа рата и сохранение активности составляет 17-30$ от исходной активности.

При гидролизе альбумина в проточной колонке с иммобилизованной протеазой сохраняется 100 активности в течение 4-х сут при 25 С. В течение 3-4 сут в гнойной ране также сохраняется 100 активности.

Преимуществом описываемого способа, по сравнению с прототипом, является использование активированной целлюлозной матрицы для иммобилизации протеазы.

В связи с этим получен высокий процент сохранения активности препарата иммобилизованной протеазы и высокая стабильность препаратов при гидролизе белков.

Приведенный ниже пример служит иллюстрацией описываемого способа.

Пример. 100 г влажной АЭ-целлюлозы (сухой вес 50 r) суспендируют в 230 мл 1 M калий-фосфатного буфера, рН 7,5: добавляют к полученной суспензии 75 мл 25 -ного водного раствора глутарового альдегида.

Смесь перемешивают в течение двух ч, Формула изобретения

СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПРОТЕАЗЫ

- ВАС1Ш/3 ЯОВТ103, включающий активирование матрицы с помощью глутарового альдегида и последующую иммобилизацию протеазы, отличающийся тем, что, с целью фильтруют. Осадок на фильтое промывают водой 1 М водным раствором NaCI и вновь водой.

К активированной АЭ-целлюлозе при5 ливают 250 мл раствора, содержащего 1375 мг белка с удельной активностью 2 ед. акт/мг в 0,1 М калий-фосфатном буфере.

Смесь инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 10-12 ч при 5 С, Пол10 ученный продукт отфильтровывают, промывают 1 M водным раствором NaCl до отсутствия оптической плотности в смывах, измеренной при 280 нм, и затем промывают водой; В результате получают 100 r иммоби15 лизованной протеазы с удельной активностью 32-40 ед. акт/г сухого веса с сохранением активности 17-30 от активности протосубтилина, взятого для иммобилизации при использовании казеина в

20 качестве субстрата. (56) Goldstein L. Nfater !пзо!иЫе enzymes

Biochemistry 9, 2322, 1970, Калашникова А.M. Термо- и рН-стабиль25 ность растворимой и иммобилизованной на силохроме С-80 протеазы Вас. subtllls. Прикладная биохимия и микробиология И(6) 842, 1975. увеличения процента сохранения активйо35 сти протеазы, в качестве матрицы используют аминоэтилцеллюлозу, а ее активацию проводят в 0,1 - 1 M фосфатном буфере при рН 6 - 9 в течение не менее 2 ч.