Способ получения д-рибозы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

с !

Союз Советскив

Социалистических

Рес тблик

ОПИСАН ИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

68663!

К ПАТЕНТУ (6l ) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 2L11,73 (21) 2080503/28-13 (23) Приоритет — (32) 23.11.73 (3} ) 131955/73 (ЗЗ) Япония (51) М. Кл.

С 12 D 13/10

l îñóäàðñòâåííûé комитет, СССР ио ленам итобретеиий и открнтий (Я) УЙК 663.15 (088.8) Опубликовано 150979Бюллетень М 34

Дата опубликования описания150979

Иностранцы

Кен-Ичи Сасадэима Мунехару Дои, Теруо Фукухару, Акира Екота, Есио Накао н Масахнко Енеда (Япония) (72) Авторм нзобретенню

Иностранная фирма

"Такеда Кемикал Индастриз, ЛТД (Япония) Pl) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ D ÐÈBOÇÛ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается техники получения D-рибозы.

Наиболее близким к описываемому изобретению является известный способ получения D-рибозы, предусматривакщий культивирование микроорганизмов рода BaciEEus на питательной среде с последующим выделением

D-рибоэы (1) . l0

Используемые в известном способе микроорганизмы из рода Baci ttus обладают довольно низкой 2-дезокси-D-гликозной окислительной активностью, составляквцей 0,01-0,02 микро- 15 моля/MHH/ìã белка и высокой способностью к спорообраэованию.

Указанный известный способ не обеспечивает достаточно высокого выхода

Р-рибоэы. .ЯВ

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения D-рибоэы нз рода BacifXus используют микроорганизмы, обладающие по крайней иере одним иэ двух свойств: частотой спорообразования, равной 2õ10 а -10 или 2-деэокси-Р-глюкоэооксидирумцей активностью, составлякщей 0,05-1,00 © микромоля/мнн/мг белка и транскетолазной активностью не более 0,01 микромоля/мин/мг белка или D-рнбулоэофосфат-3-эпимеразной активностью, составляющей не более,0,01 микромоля/мин/мг белка, например штаммы

BaciXfus рыт1Eus 9911 (}ГО 12566), М 1027 (1FO 13585) и Р 1083 (lFO

13620), а также BaciKPus subtiPis

У 957 (f FO 13565), В 941 (}ГО 13573)р

М 1054 ()ГО 13586), М 1067 (} Fp 13588) н 9 1097 (} FO 13621) и т.д.

В питательной среде в качестве источников углерода ислользуют

D-глюкозу, D-фруктозу, D-манноэу, сорбит, D-маннит, сахароэу, мелассу, продукты гидролиза крахмала, крахмал, уксусную кислоту и этанол.

В качестве источников азота используют органические вещества, например жидкость для эамачнвания зерна (кукурузы), хлопковые отходы, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, рыбью муку, мясной экстракт, пептон, казаминокислоту н такие неорганические вещества, как, например,водный раствор аммиака, газообразный аммиак, сульфат аммония, нитрат аммония, хлористый аммония, карбонат

686631 аммония,фосфат аммония, нитрат натрия и т.д., а также такие органические аэотсодержащие вещества, как мочевина, аминокислоты и т.д.

Кроме того, в питательную среду вводят. также различные металлы, витамины, аминокислоты.и другие росто,вые вещества для микроорганизмов .(в произвольном соотношении).

Культивирование микроорганизмов осуществляют в аэробиых условиях, преимущественно путем встряхивания культуры или погружения культуры при разбрызгивании и перемешивании, Температуру инкубации выбирают

s интервале 20-45©С,в зависимости от требуемой температуры для роста индивидуального организма и накопления D-рибозы, рН среды 5-9. для поддержания, рН среды в нее добавляют хлористоводородную или серную кислоту, водный раствор аммиака, газообразный аммиак„ водный раствор гидрооккси натрия, карбонат кальция, гашеную известь.

Процесс накопления D-рибоэы в среде проводят в течение 2-5 дней с последукщим выделением D-рибозы.

Культуральную среду фильтруют или цеитрифугируют, фильтрат обессоливают и обесцвечивают обработкой активированньзю углем и ионообменной смолой, а затем концентрируют.

K концентрату добавляют органический растворитель 6, например втаиоп, и отделяют кристаллы D-ps6ОЗФВ °

Н р и м е р 1. Обладающий дефицитeae транскетолазы, аспороген ый мутант Р 911 разновидности Вас13 пз

pmatfus (1рО.13566), полученнйй из вида Bacillus pumi&s ) FG 12113

В pcs уль та те облучения уль трафиоле товыми лучами (транскетолаэная активность не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина и частота, спорообразования 2хl0 В),используют для инокуляцни 10 л среды, содержащей

ОФ сорбита, 2,0% жидности для выиачивания зерна, 0,3В двуэамещенного фосфорнокислого калин, 0,1% первичного кислого фосфорнокислого калия, 100 мг/л тироэина и 100 мг/л фенил" аланина.

Эатем инокулированную среду инку= .бируют при 36 С 24 ч и все полученное количество культуры переносят в

100 мл питательной среди следующего состава,%i Ь-глюкоза 15,0 сухие дрожжи 1,0у сульфат аммония 0,5g карбонат кальция 2,0; триптофан

50 мг/л пироэин 50 мг/л; фенилаланин 50 мг/л.

Ыа этой среде культивируют при

36 С 60 ч. D-рнбоза накапливается со скоростью 64 мг/мл, Иэ жидкости фераентации Р-рибоэы клетки удаляют фильтрацией, фильтрат концентрируют до 0,5 первоначального объема, добавляют примерно одну четвертую часть этанола и осадок выбрасывают.

Оставшийся раствор обессоливают на катионо-и анионообменных смолах, а затем обесцвечивают на колонке с активированным углем.

Обесцвеченный раствор концентрируют, разбавляют четырьмя объемами этанола, получая 5 кг кристалрибозы

П р и и е р 2, Обладающий дефицитом траискетолазы аспорогенный мутант В 957 вида BaciFPus subtilus (lPO 13586), полученный из вида

Baci22us subtilis 1РО .. 3026 s резуль15 тате обработки И-метил- Я -нитронитрозогуанидином (NTG, транскетолаэная активность не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина и частота спорообразования Зх10 ) культиви2Д руют так, как описано в примере 1.

D-рибоэа аккумулируется в культуральной жидкости со скоростью

62 мг/мл, при этом получают 4,6 кг кристаллической D-рибозы, как это описано в примере 1.

Пример 3. Обладающие дефицитом эпимеразы аспорогенный мутант

1941 вида Вас18Ецз subi:ignis ((FO 13573), полученный из вида

Вас1ЮРив виЬИЖз 1рО 3026 пОсле облучения ультрафиолетовыми лучами (пимераэная активность не более

0,1 микромоля/мин/мг протеина, частота спорообразования 7xlO ), куль" тивнруют аналогично примеру 1.

D-рибоза накапливается со скоростью примерно 65 мг/мл, при этом получают 4,3 кг кристаллической D-рибоэн, как это описано в примере 1.

П риме р 4. Мутант 9 1027

Щ разновидности Baci ЙРыз pumi Pus (tFO 13585), имеющий дефицит транс" цетолаэы и обладающий высокой 2-pesокси -D-гхпокоэооки жительной акти вностью (транскетолаэная активность не более 0,01 мнкромоля/мин/мг протеина, 2-дезокси-D-глюкоэоокислительная активность 0,28 микромоля/мнн/мг протеина), который получен иэ вида Bac122us pumi8us I!F012092

5() прн облучении ультрафиолетовыки лучами, культивируют, как описано в примере 1. 0-рибоэа накапливается со скоростью, примерно 63,2 мг/мл, при этом получают 4,8 кг кристаллияя ческой D-рибозы так, как описано в примере 1.

Пример 5. Иутант Р 1-054

HaciIBus subtifis (ГО 13586), обладающий дефицитом эпимеразы и имеющий высокую 2-дезокси-D-глюкозоокислительную активность (эпимеразная активность не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина, 2-деэокси-D-глюкозоокислительная активность0,31 микромоля/мнн/мг протеина), который получен из вида Bacillus

686631

Формула изобретения

Составитель Н.Бражникова

Редактор Л.Емельянова Техред Н.Бабурка Корректор Е.Папп

Заказ 5366/57 Тир аж 52 б Подпи сн ое

ПНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент . г. Ужгород, ул. Проектная, 4

subti Qis lFO 3026 c a oT o N-метил-N Hèòðo-N-нитрозогуанидином, культивируют, как описано в примере 1.

D-рибоза накапливается со скоростью примерно 65,7 м /мл, при этом получают 5,1 кг кристаллов D-рибозы, 5 как описано в примере 1.

Пример б. Мутант 9 1067 вида

Baci QQus subti Qis I FO 13588, обладающий дефицитом транскетолаэы,имеющий высокую 2-деэокси-D-глюкозоокислительную активность (транскетолазная активность - не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина, 2-дезокси-D-глюкозоокислительная активность

0,33 микромоля/мин/мг протеина), который получен из вида Baci PQus

subti Eis (FO 3026 обработкой NI

-метил-;И -нитро-И-нитрозогуанидином, культивируют так, как описано в примере 1. D-ðèáîçà накапливается со скоростью примерно 66,5 мг/мл, 20 при этом получают 5,3 кг кристаллов

0-рибозы, как это описано в примере

Пример 7. Обладающий дефицитом транскетолазы и имеющий высокую

2-дезокси-D-глюкозоокислительную активность аспорогенный мутант

Р 1083 вида Baci2 Qus ршп1йцэ S 1

UFO . 13620 (транскетолаэная активность не более 0,01 микромоля/мин/мг протеина, частота спорообраэования

4х10, 2-дезокси-0-глюкозоокислительная активность 0,34 микромоля/мин/мг протеина, который получен из вида Bacillus pumiEus облучением ультрафиолетовыми лучами, культивируют, как описано в примере 1. Скорость накапливания D-рибозы

-72,3 мг/мл, при этом получают 5,6 кг кристаллической D-рибозы, как описано в примере l.

Пример 8. Обладающий дефици- 4О том транскетолазы аспорогенный и имеющий высокую 2-дезокси-D-глюкозоокислительную активность мутант

9 1097 Вас1ВВцз эцЬ1111э f FO 13621 (транскетолаэная активность не более 45

О, 01 микромоля/мин/мг протеина, частота спорообразования Эх10,, 2-деэокси-D-глюкоэоокислительная активность — 0,29 мккромоля/мин/мг протеина), полученный из вида Baci f f. :

subtiй1з 1FO 3026 облучением. ультрафиолетовыми лучами, культивируют, как описано в примере 1. D-рибоза накапливается со скоростью примерно 706 мг/мл, при этом получают

5,4 кг кристаллической D-рибозы, как описано в примере 1.

Предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известным способом повышенный выход целевого продукта эа счет способности используемых микроорганизмов накапливать D-рибозу со скоростью 65-70 мг/л, тогда как в известном способе скорость накопления 0-рибозы равна в лучшем случае 35,3 мг/мл.

Преимуществом предлагаемого способа является также пониженная способностью микроорганизмов к спорообразованию, благодаря чему не требуется специальной методики удаления спор.

Способ получения D-рибозы, предусматривающий культивированйе микроорганизмов рода BaciEtus на пита» тельной среде с последующим выделением Р-рибозы, о т л и ч а ю Щ и и « с я тем, что, с целью повыаения выхода целевого продукта, иэ рода

Baci QQus используют микроорганизмы, обладающие по крайней мере одним из двух свойств: частотой спорообраэования, равной 2 10 -10, или 2-деэокси-D-глюкозооксидирукщей активностью, составляющей 0,05-1,00 микромоля/мин/мг белка,н транскетолаэной активностью не более,чем 0,01 микромоля/мин/мг белка или D-рибулозофосфат 3-эпимеразной активностью составляющей не более,чем 0,01 микромоля/мин/мг белка.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

l. Патент Великобритании 91255254, кл. С 2 С, опублик. 1971.