Способ получения антигена

Способ получения антигена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

:,.:„г вава .С1т

О g И„„„„.„,ф„И Е

И ЗОБвзЕТЕ ИЯ

Союз Советских

Соцмапмстмческмн

Респубпмк (1686737

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 24.10.77 (21) 2536527/28-13 с присоединением заявки .1чв— (23) Приоритет— (5l)M. Кл.

А 61 К 39/02

Государстевнньгй квинтет

СССР оо делам нвобрвтвннй н открогтнй

Опубликовано 25.09 79 Бюллетень Ж 35

Дата опубликования описания (У) УДК 616-097 (088.8) (72) Авторы изобретения

М, Ф. Дзадзиева, Г. П. Сомов, H. Ф. Тимченко и В. В. Матияш

Владивостокский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА

Изобретение относится к области медицины, а именно получению диагностических препаратов.

Известен способ получения антигена путем выращивания культуры бактерий псевдотуберкулеза на питательной среде с последуюшей последовательной экстракцией полученной биомассы раствором хлористого натрия и мочевины, осаждением ее и выделением целевого продукта 11).

Однако такой способ не обеспечивает получения антигена, обладаюшего специфической активностью в тесте кожной пробы, и показателя повреждаемости нейтрофилов у больных псевдотуберкулезом.

Целью изобретения является получение антигена, обладаюшего специфической активностью в тесте кожной пробы и показателя повреждаемости нефтрофилов у больных псевдотуберкулезом.

Это достигается тем, что для выделения целевого продукта используют осадок биомассы, подвергают его диализу, концентрируют и удаляют иэ него токсические липидные компоненты путем экстракции.

Способ осуществляют следующим образом.

Выращивают возбудитель псевдотуберкулеза

5 о на мясопептонном агаре при температуре 12-14 С в течение 48 час. Смывают культуры и отмывают от возможных примесей среды физиологическим раствором (центрифутированне при 3000o6/мин, 3-кратно в течение 30 мин. После этого обезвоживают бактериальную массу ацетоном, охлажденньгм до — 20 С. Экстрагируют 2,5%-ным раствором хлористого натрия, супертанат отбрасывают. Отделяют осадок центрифугированием при

4000 об/мин в течение 30 мин. Экстрагируют осадок 2,5 М раствором мочевины, супертанат можно использовать для приготовления диагностикума. Затем проводят диализ водонерастворимого бактериального остатка. Лиофилизируют массу, экстрагируют токсический липидный компонент из водонерастворимого остатка по методу Фолча (хлороформ-метанол 2:1 об/об. Высушивают препарат лиофилизацией или струей холодного воздуха. ф

68 6731

Формула изобретения

Подписное

:Тираж 672

ЦНИИПИ Заказ 5588/6

Филиал ППП ""Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Затем приготавливают рабочий раствор аллергена на эабуферном растворе и фасуют аллерген по ампулам.

Стерилизацию проводят текучим паром в автоклаве при 110 С в течение 20 мин.

Проверяют препарат на стерильность следующим образом.

Содержимое ампулы высевают на три косяка мяса — пептонного бульона. Пробирки помещают в термостат при температуре 37 С, в течение 5-7 дней пророста сред не наблюдали.

Затем проверяют препарат на безвредность.

Для этого белым мышам (3 — 5 штук) весом

14 — 16 г вводят пять кожных доз (0,5 мл) внут l S рибрюшинно или подкожно. Срок наблюдения эа животными трое суток. Падежа животных не отмечал и.

Постановку реакции повреждаемости ней-. трофилов проводят следующим образом.

Берут две стерильные пробирки — одну контрольную, другую опытную. Антиген разводят

5%-ным раствором цитрата натрия в концентрации 1250 мкм в 1 мл.

Разведенный антиген разливают по 0,02 мл на дно опытной пробирки. В контрольную наливают 0,02 мл 5%-ного цитрата натрия беэ антигена.

Кровь у больных берут из пальца; 0,08 мл помещают в контрольную пробирку и столько же в опытную. В пробирке легко встряхивают и ставят в термостат на два часа.

По истечению этого срока содержимое пробирок вновь легко встряхивают, готовят мазки, 35 подсушивают их на воздухе, фиксируют в смеси с растворами аэотнокислого кальция и азотиокислой меди и формалина в течение 40 мин.

Проводят через три порции 96 этилового спирта по 10 мин в каждой, подсушивают на воздухе и окрашивают дистохимической реакцией на гликоген.

Инокуляцию мазка проводят в течение 2030 мин. при комнатной температуре в растворе периодата калия.

Промывают дистиллированной водой, затем .погружают на 20 — 25 мин вреактив Шиффа и обрабатывают в сернистой воде в течение 10—

15 мии.

Отмывают в дистиллированной воде (10—

15 мин). Препарат обрабатывают в растворе гематоксилина в течение 2 — 10 мин, В препаратах (контрольный и опытный) считают по 100 нейтрофилов, классифицируя их на нормальные и поврежденные . Результаты подсчета обрабатывали по формуле

Но . 100 где Но — число поврежденных нейтрофилов в опыте;

Н вЂ” число поврежденных нейтрофилов в контроле;

100 — количество просмотренных в мазке клеток.

При просмотре препаратов от 50 больных дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой показатель повреждаемости нейтрофилов (ППН) составил 0,21 — 0,3 + 0,02, Реакции, проведенные в качестве контроля специфичности с группой практически здоровых людей, дали показатель повреждаемости нейтрофилов равный

0,01 — 0,001. Постановка определения покаэателя повреждаемости нейтрофилов с указанным алегреном и кровью больных другими инфекционными заболеваниями (брюшной тиф, дизентерия, болезнь Боткина, коревая краснуха, раз- личные виды ангины) дала средний показатель повреждаемости нейтрофилов 0,03 + 0,001, что свидетельствует о высокой специфичности препарата.

Предлагаемый способ обеспечивает получение антигена, обладающего специфической активностью в тесте кожной пробь., и показателя повреждаемости нейтрофилов у больных псевдотуберкулеэом.

Способ получения антигена путем выращивания культуры бактерий псевдотуберкулеэа на питательной среде с последующей последовательной экстракцией полученной биомассы раствором хлористого натрия и мочевины, осаждением ее и вьщелением целевого продукта, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью получения антигена, обладающего специфической активностью в тесте кожной пробы, и показателя повреждаеМости нейтрофилов у больных псевдотуберкулезом, для выделения целевого продукта используют осадок биомассы, подвергают его диалиэу, Ф концентрируют и удаляют из него токсические липицные компоненты путем экстракции.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР И 529833, кл. А 61 К 39/02, опублик, 1976,