Способ получения антивирусных препаратов из дрожжей

Патент 687120

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСжН ЗЕ (1!) 687 j,:„ :0

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ с I (61) Дополнительное к авт. свил-вувЂ” (22) Заявлено 01.03.?8 (21) 2584504(30-15 (51) M. Кл. -

С 12 K 5!00

A 01 Х 15/ОО с присоединением заявки №вЂ”

Государствонный ноинтот

СССР оо делам нэооротоннй н открытнй (23) ПриоритетвЂ” (53) УДК57715, .072:632.981 (088.8) Опубликовано 25.09.79. Бюллетень №35

Дата опубликования описания 05.10.79 (72) Авторы изобретения

А. Г. Коваленко и А. Д. Бобырь (71) Заявитель

Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

ИЗ ДРОЖЖЕЙ

Изобретение относится к технологии получении физиологически активных веществ для сельского хозяйства.

Известен способ получения антивирусных веществ, преимущественно из дрожжей

Candida tropicalis Зв и Candida агЬогеа

КАМ-1, выращиваемых на солодовом сусле (1). Этот способ включает операции отделения дрожжевых клеток от культуральной жидкости, концентрирования культура 1b» ной жидкости в вакууме, центрифугирования, диализа и осаждения целевого продукта органическим растворителем, обработки рибонуклеазой, фенолом и органическим растворителем.

Недостатком известного способа является низкий выход, малая активность получаемого продукта.

Целью изобретения является повышение активности и выхода антивирусных препаратов.

Это достигается применением расы К-41

Сапд id a trop i ca! is в качестве продуцента антивирусных веществ, отличающейся от ранее использованных дрожжей более высокой продуктивностью и способностью усваивать углерод из пищевого сырья прн повышенных температурных режимах культиви-. рования. Применение минеральной среды Ридер с глюкозой и биотином для выращивания дрожжей способствует накоплению значительных количеств антивирусных веществ.

Кроме того, концентрирование и очистка веществ с антивирусной активностью достигаются диализом через полупроницаемую мембрану против высокомолекулярного гидрофильного вещества вЂ” полиэтиленгликоля.

Из технологической схемы приготовления антивирусных препаратов исключается дорогостоящая рибонуклеазная обработка, а окончательное высушивание препарата производится путем сублимации, что обеспечивает его хорошую растворимость в воде и высокую активность.

Г1о предлагаемому способу можно выделить антивирусные препараты как из клеток дрожжей, так и из культуральной жид2о кости. 11ри этом необходимо последовательное выполнение следующих операций.

Дрожжи Candida tropicalis К вЂ” 41 выращивают в ферментерах на аэоипованной

687120 жидкой среде Ридер следующего состава (г/л): (NH4) SO4 3, NaCI 0,3; AgS0 0,4;

KHg РО 1; Кг НРО4 0,1; глюкоза 25; биотин 2 мкг/л.

Дрожжевые клетки от культуральной жидкости отделяют центрифуги рова и ием (3000 об/мин в течение 15 мин), высушивают в сублимационной сушке при 30 С, давлении 10 н/м и используют отдельно для получения различных препаратов.

Биомассу дрожжей гомогенизируют в сухом и влажном виде в присутствии абрази ва, раствори мые вещества экстра ги руют теплой (до 45 С) водой и концентрируют с помощью водного раствора высокомолекулярногоо полиэтиленгликоля (молекулярна я масса > 15000) через полупроницаемую (целлофановую) мембрану. Растворенные в воде концентраты культуральной жидкости или дрожжевого экстракта центрифугируют (5000 об/мин в течение 15 мин) для удаления нерастворимого остатка, добавляют равный объем смеси водонасыщенного фе- о нола к н-бутанола (10:1) и эмульгируют при комнатной температуре в течение 30 мин.

Водную фазу отделяют центрифугированием (3000 об/мин в течение 30 мин), диализируют против проточной воды (48 час) для удаления остатков феноал и н-бутанола а концентрируют до минимального об ьема (0,2 вЂ” 0,3 л с помощью полиэтиленгликоля через полупроницаемую мембрану. Целевой продукт из концентрата осаждают органическим растворителем (80 /о-ным 3Q этанолом) при низкой (2 С) температуре.

Осадок уплотняют центрифутированием (5000 об/мин в течецие 15 мин) и расгBoряют в теплой (до 45 С) воде. Раствор центрифугируют (5000 об/мин в течение 15 мин) осадок отбрасывают, а супернатант повторно обрабатывают фенолом и органическими растворителями, как указано выше. Окончательное высушивание препарата из водного раствора осуществляют в сублимационной суц ке (-30 С, 1Оз н/м г )

Пример l. В качестве источника антивирусного препарата использована биомасса дрожжей Candida tropicalis К вЂ” 41. Из

500 г сухих дрожжей по предлагаемому способу получено 11,0 г препарата, что составляет 2,2 вес. /Оис,ходног.о материал.а. .Пре- 4> парат имеет вид аморфного белого порошка, хорошо растворим в воде, в растворе термостабилен. Влажность лиофилизированного препарата 5,0 /p, препарат слабо гигроскопичен, может длительное время храниться в сухом месте без изменения физических свойств и антивирусной активности.

Пример 2. В качестве источника антивирусного препарата использована культура льная жидкость, не содержащая дрожжевых клеток. Из 20 л культуральной жидкости (около 50 г сухих веществ) по предлагаемому способу получено 2,2 г препарата, т, е. около 4,4 вес. /p исходного продукта. Выделенный препарат вЂ” белый аморфный порошок, хорошо растворим в воде, в растворе термостабилен, его влажность не превышает 6О/о, может храниться длительное время в сухом месте без потери порошковидной консистенции, растворимости и антивирусной активности.

Общий выход препаратов из биомассы и культуральной жидкости дрожжей достигает 3,3 /р сухого веса исходного материала.

В табл. I приведены сведения о химическом составе препаратов, в табл. 2 и 3вЂ” результаты испытания их активности в отношении вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля.

Прспараты состоят преимущественно из полисахаридов (около 70"/p), примеси белков не превышают вЂ” 3"/,, нуклеиновых кислот 0.21 вЂ” 0,26 /p (табл. 1) . Седиметационным анализом установлена гомогенность препарата, выделенного из дрожжевых клеток, молекулярная масса присутствующего в нем полисахарида маннана равна 14000. П репарат, полученный из культуральной жидкости дрожжей вЂ” полидисперсный.

Оба препарата обладают выраженной активностью в отношении вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля: 50 /О-ное снижение инфекционности вируса табачной мозаики наблюдается в 0,000! вЂ” 0,001 /о-ной концентрации препаратов (табл. 2). Препараты подавляют накопление Х-вируса картофеля в листьях дурмана, реагирующих системным заболеванием на заражение этим вирусом (табл. 3), и увеличивают выход безвирусных растений в культуре апикальных меристем.

687120

Таблица 1

Хнмнческнй состав антнвнрусных.препаратов, полученных нз дрожжей Candid Ь срывай

К-41 (% сухого веса препарата) Источннк Редупкрующне вещества, обнаруженные в гидролнзатах

Бепкн Нукпенновые кис поты

Н укпеотндный (РНК) Обшнй мнкромето- антроповым дом Хаге- методом дорна-Иенсена

Кпеткн

70,7

0,03

1,0

66,7

0,26 следы

Культурапьная жндкость 6 8, 7

3,0

68,6

0,02

0,21 следы

П р н м е ч а н н е: Редупнруюшне вещества, обнаруженные в гндропнзатах, в 2 н. растворе Н ЯО прн 100 С в течение 6 час.

Таблица 2

Инантнвапня внруса табачной мозаики препаратами, полученными нз дрожжей

lanChda tropica8is К 41

Среднее количество нек розов на

1/2 пнста2аЫа Sbаrnои итпх) Конпептрапня препарата, %

Источник препарата

Инактнвапня вируса, % в опыте в контроле

97,8

9,0

0,2

0,1

Клетки

27,5

0,01

0,001

0,7

27,3

2,8

513

8,2

0,0001

4,0

0,3

0,1

0,01

2,3

0,001

0,0001

9,S

5,3

П р н м е ч а н н е: Опытные половинки листьев За6а.а ЬЬ амолшт ннокулнровалн вирусом табачной мозаики в присутствии антнвнрусного препарата в соответствующей концентрации, контропьные - вирусом без антнвнрусного препарата.

Культурапьная жндкость

20,0

30,2

19,2

7,0

97,5

89,7

98,5

92,4

50,4

24,3

687120

ТабпицаЗ

Влияние антивирусных препаратов на репродукцию Х- вируса картофеля в пнстьях

Радцига. 54"алпопшгп

Источник препарата

Концентрация препарата, %

Инфекционность вируса в экстракт из листьев Бадал"а $tramon,hunt купьтивируемых

Снижение инфекциоиности, % на растворе инт ибитора на воде

Клетки

CanCh da

Ь орьСабьв

О,l

307

456

3S,1

P(0,1

Культура пьная жидюсть

СаЫЫа

Ь.о1я са Я

0,1

187

87,5

P (05

1, Опытные половинки листьев содержат в течение 2 дней на растворе ингибитора контрольные - на воде, а затем инокуннруют Х-вирусом картофеля, титр вируса опредепяют на 7-й день опыта путем подсчета местных некрозов, образовавшихся в результате инокупяции экстрактами листьев гомфрены.

2. P- уровень значимости разности инфекционности вируса в опыте и контроле, %.

Примечания:

Формула изобретения

Состав итель М. Белоусо на

Техред О. Луговая Корректор М. Вигула

Тираж 526 Подписное

Редактор Д. Пинчук

Заказ 5675/27

ЦН И И П И Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал П П П «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения антивирусных препаратов из дрожжей, включающий культивирование дрожжей, отделение от культуральной жидкости дрожжевых клеток и раздельную обработку их путем концентрирования культуральной жидкости в вакууме, а дрожжевых клеток путем гомогенизации, экстракции, концентрирования экстракта, диализа, осаждения целевого продукта, обработки его фенолом и органическими растворителями, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и выхода антивирусного препарата, в качестве исходной культуры дрожжеи используют расу K вЂ” 41

Candida tropicalis, культивирование которой проводят на минеральной среде Ридер с глюкозой и биотином, а концентрирование дрожжевого экстракта проводят полиэтиленгликолем через полупроницаемую мембрану и после обработки фенолом и органическим растворителем целевой продукт из дрожжевого экстракта высушивают сублимацией.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР № 302368, кл. С 12 К 5/00, 1971.