Способ получения макромолекулярных производных аденина

Патент 691095

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Союз Советскии

Социаиистичвских

Ресйублии

< ц691О95

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (6!) Дополнительный к патенту(5Ц М. Кл.

С 08 F 8/30

С 08 F 26/06 (22) ЗаЯвлено 120675 (21) 2143264/23-05 (32) 12.06.74, (23) Приоритет(3!) Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (33) Италия

23900 A/74

Опубликовано 0510.79 Бюллетень ЭЬ 37 (%) УДК678,746..5(088 ° 8) Дата ойубликовайия описания 05.10.79

Иностранцы

Пьерджорджо Цаппелли, Лючиано Ре и Вальтер Иаркони (Италия) (72) Авторы изобретения

Иностранная Фирма

"Снампрогетти С.п.А." (Италия) Pl) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МА РОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

АЦЕНИНА

Изобретение относится к" химии высокомолекулярных соединений, конкретно к способам пблучения макромолекулярных производных аденина.

Известен способ получения макро- молекулярных производных аденина путем конденсации производного аденина с полимером в присутствии агента коиденсации. Способ заключается в реакции фосфорнокислого производного аденина с поливиниловым-спиртом в присутствии водорастворимого или неводорастворимого карбодиимида (1) .

Цель,изобретения - расширение ассортимента макромолекулярных биологически активных производных аденина.

Эта цель достигается тем, что в качестве полимера используют полимер, содержащий первичные или .вторичные аминогруппы, а в качестве производного аденийа применяют соединения формулы 0

МН-СН вЂ” CN- (СН ) -0

2 1 2 Л

М он ОН

E.. сн

2 где R вЂ” остаток никотинамид-динукле- отида, никотинамид-динуклеотид фосфата, аденозин-монофосфата, циклического аденозин-монофосфата, аденозин-дифосфата, аденоэин-трифосфата, аденоэина и аденийа; и = 1-4.-

Реакцию конденсации между карбоксильной группой функционального

10 производного аденйна и аминогруппой, принадлежащей полимеру, результатом чего является образование амидной связи, проводят в водной среде или в смеси воды и водорастворимого

18 органического растворителя (например, пиридина, тетрагидрофурана, диоксана и т.д.) при температуре в пределах от 5 до 50 С, предпочти тельно при комнатной температуре.

20 макромолекулярные производные аденина, получаемые по предлагаемому способу, имеют несколько полезных применений. Так, например, макромолекулярные прОиэводные никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД) так же, как и другие макромолекулярные производные этого типа, могут быть использованы в аффинной хроматографии или в качестве искусственных коферментов..

691095

Таким образом, когда в качестве полимерного носителя адениновых соединений применяют водорастворимые макрсмолекулы, целевые проиэводйые могут использоваться в качестве водорастворимых макромолекулярных 5 исскуственных (не встречающихся в природе) коферментов. Это расширяет область применения известных энзиматических систем, в которых фермент физнчески иммобилизован (включен) в нерастворимые структурй, такие как волокна, полиакриламидный гель, микрокапсулы и так далее, являющиеся непроницаемыми для макромолекул. Действительно, ког- > > да энзиматическая или полиэнзиматическая система иммобилизуется аМесте с водорастворимым макромолекулярным коферментом, оба они приходят в соприкосновение друг с другом, благодаря чему кофермент не диффун дирует за пределы структуры, выполняющей функции носителя, что до сих пор практически недостижимо из-за нйзкого молекулярного веса кофермента.

В случае, когда применяются нерастворимые макромолекулы, производные могут найти применение в аффин, иой хроматографии или энзиматичес.ких реакциях, которые целесообразно .проводить в гетерогенной фазе, для того, чтобы затем можно было отде лить и повторно использовать кофермент.

tl р и м е р 1. Получение 4-(HAg вЂ”,35

-И ) -3- оксибутирил-ПЭИ (и = 1, атом азота N- принадлежит макромолекулярному радикалу поли этиленимина (ПЭИ), :а ЙАД - никотинамидадениндинуклеотидный радикал формулы 40

127 мг полиэтиленимин-гидрохлорида (полученного прибавлением концентрированной соляной кислоты к полиэтиленимину, имеющему молекулярный вес порядка 50000, с последующим упариванием.реакционного . раствора досуха) растворяли в воде до получения водного раствора концентрацией 25% (вес.Ъ/об.). В этот раствор, имеющий рН 6, вводили 10 мг динуклеотида никотинамид-6-(2-окиси-3-карбоксипропиламино)пурина (и = 1 НАД-радикал формулы

l растворенного в 0,125 мл дистиллированной воды, а затем 10 мг N N-дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 0,125 мл пиридина, Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 36 ч и затем фильтровали. Фильтрат и промывание воды объединяли (общий объем

10 мл), переносили в центрифужную пробирку и добавляли в качестве осадителя 10 мл 1 M фосфатного буфера с рН 6 ° Полученную систему центрифугировали в течение 10 мин при 39000 xg и раствор (супернантант) отделяли от полимерного осадка декантацией. Полученный таким образом полимер очищали растворением в 2 мл раствора, содержащего ..

2N хлористого натрия и 0,05 М ацетатного буфера и имеющего рН 5.,5.

Этот раствор разбавляли 8 мл воды и снова осаждали полимер добавляя 10 мл

1 М фосфатного буфера с рН 6, после чего систему центрифугировали при.

39000 xg s течение 10 мин и супернатант отделяли от полимера декантацией, Эту процедуру очистки повторяли четыре раза. Полученный в итоге продукт снова растворяли в растворе 2 N NaCI и 0,05 N ацетатного буфера с рН 5,5 и диализовали в трубчатом диализаторе в течение

24 ч против 250 мл раствора 2 М

NaCI и 0,0001 М НС, Затем тот же раствор диализовали против нескольких порций 0,0001 N соляной кислоты в течение четырех дней, причем ежедневно раствор заменяли новой порцией. После этого продукт, содержавшийся в диализаторе, выделяли из раствора лиофилизацией. В результате было получено 90 мг полимера, показавшего максимум поглощения (Л, „ ) при 266 ммкм.

Определение количества НАД, ковалентно связанного с полимером и йроявляющего активность в качестве кофермента, проводили в водном растворе полимера путем количественного энэиматического восстановления полимера аЛкогольдегидрогеназой, выделенной из дрожжей, в 0,15 М раствбре трис-буфера при рН 9 в присутствии 0,5 моль этилового спирта и

0,075 моль хлоргидрата семнкарбазида °

Спектрофотометрическое измерение НАД-Н, проведенное при 340 ммкм, показало;что на 1 г полимерного производного получено 28,5 ммоль НАД, ковалентно связанного с полимером и способного восстанавливаться энэиматическим путем.

Полученный таким образом макромолекулярный НАД по сравнению с обычным, природным никотинамид- аде- нин-динуклеотидом (НАД) характеризуется заметной коферментной активностью в присутствии нескольких де-

691095

11 м к !5

30 гидрогеназ. Так, например, в присутствии лактатдегидрогеназы из мышц кролика удельиая активность макромолекулярного производного НАД порядка 55% в расчете на активность природного кофермента. Определение производили в 0,1 М аммонийкарбонатном буферном растворе при рН 8,5 и температуре 25 С.

Пример 2. Пблучение 4-(НАД-N )-3-оксибутирил-ПЭИ fn = 1, N-радикал полиэтиленимина (ПЭИ), НАДрадикал формулы

125 мг полнэтиленимина, полученного в соответствии с методикой, описанной в примере 1, в водном 25% (вес/объем) растворе при рН 6, при- 2() бавляли к 40 мг никотинамид-6-(2-окси-3-карбоксипройилаМино)-пуринди нуклеотида ; f п = 1, НАД вЂ” ради- кал формулы

6 продолжали в течение 4 дней против нескольких порций (по 250 мл каждая)

0,0001 M раствора соляной кислоты, . причем ежедневно раствор заменяли на новую порцию. После этого раствор, содержащийся в диализаторе, подвергали с целью извлечения продукта лиофилизации. В итоге было получено 85,7 мг полимера, имеющего Л с при 266 ммкм. Определение НАД (активного в качестве кофермента), ковалентно связанного с полимерным носителем, осушествля.ли в водном растворе полимера посред ством энэиматического восстановле- ния алкогольдегидрогеназой из дрожжей в 0,15 М растворе трис-буфера при рН 9 в присутствии 0,5 моль этилового спирта и 0,075 моль хлоргидрата семикарбазида. Спектрофотометрическое измеренйе при 340 ммкм образовавшегося в результате энзиматической реакции НАД-Н производного позволяет считать, что .полученный полимер содержит 125 ммоль знзиматически восстанавливаемого НАД на

1 г полимера.

Пример 3. Получение 4-(НАДИ ) -3-оксибутирил-ПЛИЗ-(n = 1, Nрадикал поли -L-лизина (ПЛИЗ),. НАД.. радикал формулы растворенного в 0,5 мл воды, после чего туда же вносили 40 мг М-этилN - (3-диметиламинопропил) -карбодиимид-гидрохлорида растворен ного в 0,5 мл воды. Реакционную смесь 35 подшелачивали до рН 5,5, добавляя

1 М раствор МаОН, после чего перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч . Затем реакционную смесь разбавляли водой до общего объе 40 ма 10 мл, переносили в центрифужную пробирку и в ней осаждали полимер 10мл

1М фосфатного буфера с рН б. Систему центрифугировали в течение

10 мин при 39000xg после чего раствор отделяли от полимерногб осадка декантацией.

Для дальнейшей очистки полимера его растворяли в 2 мл раствора 2 М

NaCI и 0,05 М ацетатного буфера с рН 5,5. К полученному раствору.. прибавляли 8 мл воды и полимер снова осаждали 10 мл 1 М фосфатного буфера с рН 6, Далее систему центрифугировали в течение 10 мин при

39000 xg причем полимер отделяли от супернатанта декантацией. Описанную процедуру очистки осуществляли

4 раза. Полученный полимерный продукт снова растворяли в растворе

2 М NaCI и 0,05 М ацетатного буФе- 60 ра, имеюшем рН 5,5. Раствор пере= . носили в сосуд: для диализа (диализатор) и диализовали в течение 24 ч против 250 мл водного раствора 2М

NaCI и 0,0001 М HC8 . Затем диализ

100 мг бромгидрата поли -L-лизина, имеюшего молекулярный вес 50000, растворяли в 1 мл воды и прибавляли к раствору 40 мг никотинамид-б(2-окси-3-карбоксипропиламино) -пу- . риндинуклеотида (и = 1, НАД вЂ” радикал Формулы

I в 0 5 мл воды, после чего туда же прибавляли 40 мг N-этил-И вЂ (3-диметиламинопропил)-карбодиимид-гидрохлорида, растворенного в 0 5 мл воды. РН реакционной смеси доводили до 5,5 с помошью 1 М раствора NaOH, В таком виде реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч, после чего переносили в аппарат для диализа (диализатор) и диализировали в течение 24.ч против 250 мл раствора 2М

NaCt и 0,0001 и НСС, Затем этот же продукт диализировали в течение

4.дней против нескольких порций

0,0001 М соляной кислоты объемом

250 мл каждая, причем ежедневно раствор заменяли новой свежей порци691095 лйчества 1 M соляной кислоты) не

r прекращая медленно ее перемешивать.

Реакцию продолжали в течение 24..ч, после чего гель отфильтровывали, промывали (сначала 200 мл раствора 1 М ИаСМ и 0,0001 М НСЕ, а затем дистиллированной водой),В результате было получено примерно 1,8 мл влажного геля, имеющего л,о с при

266 ммкм. Содержание НАД-групп, щ ковалентно связанных с гелем Сефарозы, определяли спектрофотометрически путем измерения при 266 ммкм окисленной формы кофермента (НАД) и при 340 ммкм - кофермента (НАД-Н), энзиматически восстановленного алкогольдегидрогеназой,. выделенной иэ дрожжей," в 0,15 M растворе трис-буфера при рн 9 в присутствии 0,5 моль этилового спирта и 0,075 моль хлоргидрата семикарбаэида. Образцы для

УФ-снектрофотометрических измерений готовили путем суспенэирования геля в водном 1В-нсм растворе РоГуох N/R301, который замедлял седиментацию геля. По результатам измерения оптиИ5 ческой плотности геля при 266 ммкм было рассчитано, что на 1 г сухой

Сефарозы получейо 2,04 моль (суммар= но) НАД-групп, .ковалентно связанных с носителдк.

30 После знэиматического восстановленин и измерения оптической плотности при 340 ммкм установлено, что количество энзиматйчески восстанавливаемых НАД-груп, ковалентно связан35 ных с йолимерным носителем, составляет около 1 15 ммоль на 1 г сухой Сефарозы. ей. Продукт, содержавшийся в диализаторе, выделяли из раствора посред- ством лиофилизации. Выло получено

75,4 Mr полимера< имеющего, )Л „ „с при 266 ммкм.

Определение содержания .в полимере остатков НАД, ковалентно свяэайных с поли-L-лизином и. ответственных за коферментную активность продукта, проводили спектрофотометрическим методом после количественного энзиматического -восстановления полимера алкогольдегйдрогенаэой, вйделейной из дрожжей, в 0,15 14 растворе трисбуфера при рй 9 в присутствии 0,5 моль этилового спирта и 0,075 моль хлор1идрата семикарбаэида, измеряя при 340 мякм количество образовав шегося" НАД-Н производного, Проведенный анализ показал, что полученнйй полимерный продукт содержал 90 ммоль энзиматически восстанавливаемого, ковалентно связанного с полимером никотинамидадениндинуклеотида на

1 г йолимера. 6

Пример 4. Получение 4-.(НАД-N ) -3-оксйбутирил-АРСЕФ f n 1, N-радикал Сефарозы 4В, активированной бромцианом и обработанной эа гем I,б-диаминогексаном, в результате чего содержавшей от б до 10 моль остатков амина на 1 мл геля (АГСЕФ), НАД - радикал формулы

4& J

500 мг АГСЕФ (AHSEI H; торговая марка AH Sepharose-4B ) подверга ли набуханию в 0,5 М . водном раст- . воре NaCh затем гель промывали

200 мл 0,5 М раствора NaCE и затем дистиллированной водой. По получении объема геля порядка 2 мл к нему прйбавляли рас гвор 92 мг нико- тинамид-б-(2-окси-3-карбоксипропил амино)-пуриндинуклеотида (й = 1, НАД - радикал

3(Н Я

) вЂ” в 2 мл дистиллированной воды и рН системы доводили до 5 с помощью 1 М водного раствора NaOH. Полученную суспензию перемешивали при комнатной температуре с помощью низкоскоростной механической мешалки и затем осторожно, по каплям прибав-: ,,ляли 75 мг N-этйл-N --(3-диэтиламино- Я пропил) - карбодиимидгидрохлорида, : растворенного в 2 мл дистиллированной воды. В течение первых 5 ч рН суспензии: поддерживали на уровне 5 (прибавлением соответствующего коФормула изобретения

1. Спбсоб получения макромолекуЛярных производных аденина путем конденсации производного аденина с rro>, лимером в присутствии карбодиимидов в растворе, отличающийся тем, что, с целью расшир6ния ассортимента,макромолекулярных биологически активных производных аденина, и качестве производного аденина ис-. пользуют соединения формулы

HH= цф - Цц- (бнЯ ) л 6.

М. И ОН и юн

З где п 1- 4, и - остаток никотинамид-динуклеотида, никотинамиддинуклеотидфосфата, аденозин-монофосфата, цикли. ческого аденоэин-монофосфата, аденоэин-дифосфата, аденоэин-трифосфата, аденозина и аденнна;

691095

Составитель A. Переверзева

Р актоР Л. Ушакова: Техред М.Келемеш Корректор О, Ков„низкая

Заказ 5820/57 :. Тираж 585 : Подписное

ЦЙИИПИ Государственнбго комитета СССР по делам.изобретений и открытий

035 М Скв . Ж-35 Ра ская наб., д. 4/5

113, о а,, уш

Филиал ППП ."Патент™, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в качестве полимера используют содержашйе первичйие или вторичные аминогруппи йолвмера.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юш и и с я .тем, что, реакцию конденсации проводят в воде или в смеси води и водорастворимого органического. растворителя.

3. Способ по и, 1, о т л и ч а ю шийся тем, что конденсацию проводят при температуре 5-50 С.

Источники информации, принятые so внимание при экспертизе

1. JouinaI of Масгошо? . Science

Р б, с. 1297/1.311,"1973 (прототип).