Способ получения коллагеназы

Способ получения коллагеназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1, ОПИСАНИЕ ,ИЗОБР ЕТЕ Н И Я еив 0еветскик

Свциелистических (»I694534

Геспубиик

К ABTOPCKOMTr В:rPETE.II CTBTr

I (61 I rrufrO (rlur Л(ПОС г; ЗВf (Ви g-är, --!

1 (22) 3 аявлено 20,03.78 (21) 2592886/28-13

r (51) М. Кл.

С 12 D 13/10 с присоединением заявки №вЂ”

Гвсудерствеииый ксмитет

1 (23) Приоритет— лв лелем извбретешя и открытий (43) Опубликовано 30.10.79. Бюллетень ¹ 40 (45) Дата опубликования описания 30.10.79 (53) УДК 615.779.94 (088.8) (72) Авторы изооретсння

В. С. -ожд "-.scícf(àÿ, А. И. Углева и

Т. И. 3 амысл о в а

Ленинградский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ

Изобретение относится к области микробиологии и касается производства бактериальных ферментных препаратов.

Известен способ получения коллагеназы путем культивирования продуцента

Clostridium histoliticum в анаэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с последующим выделением и очисткой целевого продукта. Активность коллагеназы составляет ,500 КЕ/мл, токсичность — 80 DL М/мл

М

Однако известный способ f(e позволяет получить целевой продукт, обладающий высокой активностью и низкой токсичностью.

Целью изобретения является повышение активности и снижение токсичности целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что в качестве продуцента используют штамм Clostridium histoliticum 468, а культивирование .ведут на питательной .среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу.

Ш а,гм Clostridium histoliticur; хранится в коллекции культур микроорганизмов Государственого контрольного института медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича.

К1/.гьтурально-.чорфо.гогические признак(г. (o . жпая грзм-»зложптельная палоч ка размером 0,5 — 0,7);3 — 5 мкм. Образует сгпоры.

Агар. Образует колонии в виде комочков ваты.

Бульон с глюк(,зо:» Пом1 гненнс с образован ием на дне легкого осадка.

Кровяной агар. Гемолиз.

Физиолого - биохилгичеекие признаки.

Анаэроб, оптимум роста при 37 С.

Углерсгды не ферментирует.

Индол не образует.

Молоко свертывает. г5 Активно продуцирует коллагеназу.

Способ осуществляется следующим ооразом.

Культуру С!. histoliticum засевают в

2г бульон Рамона с добавлением 1 (I (по объему) глюкозы следующего состава:

Мясной гидролизат 250 мл

Водопроводная вода 250 мл

Мясная вода (1:1000) 500 мл

25 Поваренная соль (x. ч., 1,o) 10 г

Кровяной порошок 5 г

Глюкоза 10 г

Культивирование проводят 48 ч прп температуре 37 С. Затем фильтруют через з(г стсрилизующпе л; с тины фильтра Саль694534

Составитель Е. Дубовицкая

Тскр д Л. Камы панкова I(nappe>cv.оp Л. Степанова

Рс..иктор Д. Павлова

Подписное

Изд. № 633 Тираж 549

НПО «Поиск»,, осударствснного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, 1ааушская наб., д. 4/5

Заказ 7030

Загорская типография Упрполиграсриздата Мособлисполк< а

3 янкова. Фильтрат осаждают 60%-,ным сульфатом аимо ния, оставляют на 16 — 20 ч лри (+6) — (+8) С. Образовавшуюся на поверхности пленку растворяют в 0,85%-ном растворе поваренной соли. Полученный раствор, м инуя стадию диализа и высушивания, подвергают очистке методом гель фильтрации на колонке, заполненной сефадексом G 100. Степень очистки коллагеназы составляет 3300 — 8333 КЕ/мг общ. 10 азота).

Пример. 10 мл культуры Сl. Ыз101г. icum

468 засевают в 4 л бульона Рамона с

1 /О-ной глюкозой, прогретого до 50 — 60=С.

Выращенную культуру фильтруют через 5 фильтрующие и стерилизующие фильтры

Сальникова, предварительно смоченные физиологическим раствором пова ренной соли.

Полученный фильтрат осаждают сульфатом аммония из расчета 6 кг соли на 10 л фильтрата. Осаждение проводят при комнатной температуре. Выпавший осадок интенсивно перемешивают с надосадочной жидкостью и оставляют при температуре ,(+6) — (+8) С на 16 — 20 ч. Образовавшуюся на поверхности жидкости пленку растворяют в 0,85%-ном растворе поваренной соли, рН 7,2, в 1:50 первоначального объема. Затем проводят очистку методом гельфильтрации. Для этого полученный раствор наносят на колонку, предварительно п ромытую физиологическим раствором поваренной соли (pl- 7,0- — 7,2) и заполнсп.ную сефадексом G 100. Размер колонки

7Х55 см. Элюацию проводят физиологическим раствором, рН 7,2. Свободный объем 600 †6 мл отбрасывают и собирают фракции коллагеназы до выхода ппг4 мента и сернокислого аммония. Очищенную коллагеназу стерилизуют через керамические свечи Чамберлена 5L 7, разливают в вакуумные ампулы и лиофильно высушивают в вакуумных аппаратах. Режим сушки: замораживание при — 45 С в течение 20 — 24 ч, продолжительность высушивания 44 — 48 ч при максимальной температуре +35 С.

Активность коллагеназы составляет

1000 коллагенозных единиц в 1 мл, токсичность 2 DI- М/мл.

Использование изобретения позволит получить высокоактивный, очищенный, атоксичный препарат коллагеназы.

Формула изобретения

Способ получения коллагеназы путем культивирования продуцента Clostridium

histoliticum в анаэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с последующим выделением и очисткой целевого продукта, о т л ич а Io шийся тем, что, с целью повышения активности и снижения токсичности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм Clostridium histoliticum

468, а культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Вон росы медицинской химии, 1962, VIII, вып. 4, с. 424 — 428,