Патент 695230

Способ получения лимонной кислоты

 

(ii) 695230

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.07.77 (21) 2502883/28-13 (51) M.К .

С 12D 1/04 с присоединением заявки №

Государственный комитет (23) Приоритет

Опубликовано 23.06.82. Бюллетень № 23

Дата опубликования описания 23.06.82 (53) УДК 663.18 (088.8) по делам изобретений и открытий

А. Б. Лозинов, Т. В. Финогенова, Н. В. Шишканова, /

В. И. Илларионова, P. Я. Карклинь, И. Ж. Пелцмайе,, Л. О. Раминя, В. Т. Лука и Б. Я. Кестерис

Р)

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и,,",";;:,.

Экспериментальный завод биохимических препаратов

АН Латвийской ССР

"к (72) Авторы изобретения (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения лимонной кислоты.

Лимонную кислоту получают в основном путем культивирования специально селек- 5 ционированных штаммов плесневых грибов на средах, содержащих углеводы (сахароза, меласса, крахмал и др.) в качестве основного источника углерода, Известен способ получения лимонной 10 кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжей вида Candida lipolytica в условиях аэрации на питательной среде, содержащей нормальные парафины в качестве источника углерода, источник 15 азота, минеральные соли с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости (1).

Однако известный способ обеспечивает достаточно высокий выход лимонной кис- 20 лоты.

Целью изобретения является повышение концентрации и выхода лимонной кислоты.

Поставленная цель достигается тем, что из вида Candida lipolytica используют 2б штамм Candida lipolytica НММ-187, при этом культивирование ведут при конценттрации клеток продуцента 10 — 30 г/л по сухому веществу, рН 5,5 — 6 5 и концентрации кислорода равной 50 — 80% насыще- 30 ния.

Характеристика штамма Candida lipolytica НММ-187.

Штамм Candida lipolytica НММ-187 получен путем обработки клеток Candida

lipolytica ИБФМ у-160 (704) нитрозометилмочевиной и последующего отбора.

Мутантный штамм хранится в Отделе биоэнергетики ИБФМ АН СССР.

Штамм Сandidà lipolytica НММ-187 имеет сле цующую х ар актер истику.

Молодая культура на жидком и агаризованном сусле представлена округлыми, овальными и слегка удлиненными клетками размером 2,0 — 5,0 3,0 — 10,0 мк. Встречаются сильно удлиненные клетки размером 2,4.11,0 — 16,0 мк, а также цепочки из

3 — 4 клеток.

При росте на жидком сусле при 25 С на восьмые сутки образуется тонкая пленка на поверхности среды и небольшой плотный осадок на дне пробирки. На 15—

16 сутки пленка становится более толстой, осадок увеличивается.

Колонии на сусло-агаре (10 суток) беловато-кремовые, гладкие, матовые, выпуклые, центр колонии несколько приподнят, края ровные. Гигантская колония кремового цвета по краям желтовато-зеленая, слегка морщинистая, плоская, центр приподнятый, края слабо лопастные, 695230

40

3,0

0,7

0,5

0,4

1,0

0,1

2,0 мл

Рост по штриху плоский, гладкий, матовый, кремового цвета, края ровные.

Культура на стекле на картофельном агаре: псевдомицелий слабо развит. Строгий аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует глюкозу, этанол, ацетат, глицерин.

Слабый рост на галактозе.

Не ассимилирует лактозу, мальтозу, сахар озу, рафинозу, арабинозу, ксилозу, крахмал.

Использует (КН4)г$04 и NH4Cl в качестве источника азота.

На нитратах не растет.

Молоко пептонизирует полностью.

Оптимальная температура роста 26—

30 С, максимальная — 33 С.

Хранится на агаризованной среде Ридер с парафином и в ампулах в диофилизированном состоянии, Описанный штамм Candida lipolytica

НММ-187 хар актеризуется способностью при росте на средах с н-алканами продуцировать преимущественно одну лимонную кислоту, изолимонная кислота практически не накапливается.

Для оценки стабильности мутанта Candida lipolytica НММ-187 его пересевают в течение 4 месяцев на свежую среду с парафином (культивирование в колбах на качалке), в общей сложности проведено

40 последовательных пассажей. За время частых пересевов культура не только не утрачивает способность продуцировать преимущественно цитрат, но соотношение цитрат: изоцитрат в среде еще более сдвигается в сторону преимущественного накоплейия цитрата (от 8: 1 до 12: 1).

Хранение мутантного штамма в течение

4 лет на агаризованной среде с парафином также не ухудшает свойств этой культуры.

Мутантный штамм Candida lipolytica

НММ-187 при всех испытаниях обнаруживает стабильность основного практически важного свойства — преимущественный синтез цитрата на средах с н-алканами.

П ример 1. Дрожжи Candida lipolytica

НММ-187 поддерживают на агаризованной минеральной среде Ридер с нормальными парафинами (С1г — С„), имеющей следующий состав, г/л:

Нормальные парафины 10,0 (С 1г — C ig) (NH4) г04

MgSO4 7Н,О

NaCl

Са (NOS) г

КНгР04

КгНР04

Дрожжевой автолизат

Набор микроэлементов по Буркгольдеру *

Агар-агар 25,0

* Набор микроэлементов по Буркгольдеру включает следующие компоненты (мг/л

4 среды): КЗ 01; В 001; Мпг 0>01;

7п + 0,01; Сцг+ 0,01; Мо" 0,01; 1-"ег 0,05.

Дрожжи выращивают на косяке в течение 3 суток при 28 — 30 С. Суспензию клеток с агаризованной среды переносят в колбы объемом 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды.

Состав посевной среды, г/л;

Нормальные парафины 48,0 (NH4) г$04 3,0

MgSO4 7НгО 0,7

NаС1 0,5

Са (NOa) z 0,4

KHгРО4 1,0

КгНР04 0,1

Дрожжевой автолизат 4,0 мл

Набор микроэлементов по Буркгольдеру, Через 48 ч инкубации на качалке полученную посевную культуру переносят в новую партию колб с посевной средой, объем инокулума бо/о от объема среды.

Вторую партию колб также помещают на качалку при 28 — 30 С; во время культивирования; продолжавшегося 50 ч, рН среды поддерживают на уровне 6,0 — 6,5 введением стерильного 10 -ного раствора

КaOH.

500 мл выросшей культуры переносят в ферментационную среду. Объем среды

3,5 л.

Состав ферментационной среды, r:

Нормальные парафины 600 (Сгг — С19) (NH4) gS04 20,0

Мд$04 н о 2,8 г

NaC1 1,5

Са (NO>) г 1,6

КН,Р04 4,0

K2HP04 0,4

Дрожжевой автолизат 8,0 мл

Ферментацию проводят в ферметационном аппарате АНКУМ-2 объемом 10 л.

Процесс осуществляется при 29 — 30 С в условиях интенсивного перемешивания и аэрации среды воздухом. Концентрацию кислорода в среде поддерживают 75 — 85 /О насыщения. рН среды регулируют введением раствора NaOH на уровне 6,0 — 6,5.

Максимальная концентрация клеток продуцента на третьи сутки ферментации достигает 13 г/л.

Через 144 ч культивирования достигают концентрации лимонной кислоты 217 г/л, одновременно в среде накапливается изолимонная кислота, ее концентрация 6 г/л.

В аппарате общее содержание лимонной кислоты безводной — 868 г или моногидрата 949,2 г. Ферментационный выход безводной лимонной кислоты по весу составляет

145 /о и моногидрата 158% от внесенных парафинов.

695230

15

Формула изобретения

5,0

1,4

0,5

0,8

2,0

0,2

4,0

Составитель М. Ларина

Техред А. Камышникова Корректор 0 Тюрина

Редактор П. Горькова

Заказ 764/6 Изд. Мз 157 Тираж 505 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Я-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Пример 2. Посевной материал (10 о/о от объема среды), приготовленный аналогично примеру 1, размножают последовательно в ферментаторах емкостью 63 л и

400 л на среде следующего состава, г/л:

Нормальные парафины 48 (C12 — C19) (NH4) г$04 6,0

XgSO, 7Н,О 0,7

NaCl 0,5

Са (КОз) г 0,4

КН,РО4 1,0

К,НРО:, 0,1

Дрожжевой автолизат 2,0

Набор микроэлементов по Буркгольдеру.

Концентрация клеток продуцента (по сухому весу) достигает 30 г/л. Длительность процесса в каждом ферментаторе 20

48 ч при температуре 28 — 30 С и рН 5 0 — 5,5.

Основную ферментацию осуществляют в фермептаторе емкостью 3000 л. Коэффициент заполнения аппарата 0,6. Посевной материал вносят в ферментатор в количе- 25 стве 10 /о от объема среды.

Состав ферментационной среды, г/л:

Нормальные парафины 100 (C» — C») (NH4) гЯО»

MgSO4 7НгО

Na Cl

Са (КОз) г

КНгРО4

КгНРО

Дрожжевой автолизат

Набор микроэлементов по Буркгольдеру.

Ферментацию проводят при 28 — 30 С. 40 рН среды поддерживают на уровне 5,6 — 6,0 введением стерильного 20 /о -ного раствора

NaOH.

Концентрацию кислорода в ферментационной среде поддерживали первые сутки 45

50 — 60о/о, вторые-четвертые сутки увеличивают до 80о/о и на пятые сутки снижают до 50 о/о.

В течение процесса ферментации на вторыс-четьсртые с тки с промежутком в

24 ч добавляют в ферментационную среду нормальные парафины, каждая порция составляла 2 /о от объема среды, Максимальная концентрация клеток продуцента на вторые-третьи сутки ферментации 20 г/л.

Продолжительность основной ферментации 120 ч.

К концу ферментации общее содержание лимонной кислоты в аппарате 368 кг. Ферментациоппый выход безводной кислоты составляет 128 /о по весу от внесенных парафинов.

Использование предложенного способа позволяет наладить производство лимонной кислоты из непищевого сырья — нормальных парафинов — с более высоким выходом, чем по известным способам. Себестоимость лимонной кислоты, полученной по данному способу, значительно ниже себестоимости этой кислоты, полученной из мел ассы.

Способ получения лимонной кислоты путем культивирования продуцирующих ее дрожжей вида Candida lipolytica в условиях аэрации на питательной среде, содержащей нормальные парафины в качестве источника углерода, источник азота, минеральные соли с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода лимонной кислоты, из вида Candida lipolytica используют штамм

Candida lipolytica НММ-187, при этом культивирование ведут при концентрации клеток продуцента 10 — 30о/о по сухому веществу, рН 5,5 — 6,5 и концентрации кислорода, равной 50 — 80 о/о насыщения.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент СССР Хв 448652, кл. С 12D

1/04, опублик, 1974.