Способ получения клавулановой кислоты и ее солей

Способ получения клавулановой кислоты и ее солей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

зйс(;; " .1 tA

ВВТЕ1т. -;- . МАЙ бпблиотойа t4SA

Оп ИКАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических (11) 695565

Республик.(61) Дополнительный к патенту— (22) Заявл ено 12.10.76 (21) 2409954/28-13 (23) Приоритет — (32) 13.10.75 (31) 41898/75 (33) Великобритания (43) Опубликовано ЗОЛ 0.79. Бюллетень № 40 (45) Дата опубликования описания 17.12.79 (51) М.Кл. С 1,2 D 1/02

Государстееииый комитет

iCCCP по лелем изобретеиий и открытий (53) УДК 661.733 (088.8) (72) Автор изобретен.ия

Иностранец

Стефен Джон Бокс (Великобритания) Иностранная фирма

«Бичам Груп Лимитед» (Великобритания) (71) 3 аявитель

ПОЛУЧЕНИЯ

СЛОТЫ И ЕЕ СОЛЕЙ (54) СПОСОБ

КЛАВУЛАНОВОЙ КИ

Изобретение относится к технике получения клавулановой кислоты и ее солей.

Известен способ получения клавулановой кислоты и ее солей путем выращивания продуцирующих ее микроорганизмов рода Streptomyces на питательной среде в присутствии источников углерода, азота и необходимых минеральных солей с последующим выделением и очисткой целевых продуктов (1).

Однако чистота получаемых по известному способу продуктов недостаточно, высока.

Целью изобретения является повышение чистоты получаемых продуктов.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получение клавулановой кислоты и ее солей в качестве продуцента mcпользуют штамм Streptomyces jumonjinensis МКК1 5741.

Перед выделением культуральную жидкость юхлаждают, доводят значение рН . до 2 — 4 и экстрагируют из нее клавулановую кислоту сначала органическим растворителем, не смешивающимся с водой, а затем водным раствором бикарбоната натрия, буферным раствором гидрофосфата калия, карбонатом, калия или водой при нейтральн0м значении рН.

Ъ

Кроме того, перед выделением из культуральной жидкости экстрагируют клавулановую кислоту смесью органического растворителя и водонерастворимого амина, а затем водным раствором соли щелочного металла.

Выделение солей клавулановой кислоты осуществляют путем пропускания культуральной жидкости через смолу, имеющую полиалкиновые или четвертичноаммониевые группы, до насыщения смолы клавулановой кислотой с последующим элюированием соли водным солевым раствором.

Выделение солей клавулановой кислоты можно провод нть путем пропускания культуральной жидкости через угольный слой с последующей промывкой ф ильтрата водой и элюированием ацетатом.

Способ осуществляют следующим обра20 зом.

Клавулановую кислоту и ее соли полу ° чают путем выращивания продуцирующих ее микроорганизмов рода 8/reptomyces на литательной среде в присутствии источников углерода, азота и необходимых минеральных солей на аэробной поверхности или в погружной культуре.

В качестве продуцента используют штам S tr. j umonj inensis NRRL 5741, который депонирован в Беарне (Нидерланды)

695565

1,2 мкм, а их поверхность гладкая. Никаких цепочек конидий не замечено. Нет спорангии или жгутиковых спор; спорофоры образованы только на серийном мицелии.

Культуральные признак и. В табл. 1 показаны результаты, лолученные после культивирования в течение 2 недель при 28 С на различных культурных средах.

3. в виде CBS 177.76 и в коллекции микроорганизмов ФРГ (ЭЯМ).

Морфолопические признаки. При наблюдении в микроскоп серийный мицелий хорошо разветвлен и образует плотно уложенные спирали. Споры находятся в це.почках по 10 — 50 спор каждая. Споры ц илиндрмческие, размером 0,6 — 0,8x1,0—

Таблица 1

Обратная

1 сторона

Воздушный мицелий

Мицелий в субстрате

Растворимый пигмент

Среда

Рост

Сахар/нитрат агар

Скудный белый

Умеренный

Скудный бесцветный

Белая

Глюкоза/аспарагин агар

Хороший

Умеренный коричневато-серый

Скудный желтовато-серый

Обильный желтовато-серый

Светлая коричневато-серая с

Глицерин/аснар агин агар

Умеренный

Скудный белый

Бледная желтовато-коричневая

Умеренный желтовато-серый

Неорганические соли/крахмал агар

Тирозин агар

Скудный серовато-белый

Бледно-желтая

Хороший

Бледно-желтая

Умеренный

Умеренный бесцветный

Питательный агар

Хороший

Скудный белый

Умеренный желтовато-серый

Бледно-желтая

Бледно-желтотовато-коричневый

Дрожжевой экстракт/солодовый экстракт агар

Обильный

Обыльный белый до коричневатосерого

Обильный желтовато-серый

Неясно-желтая

Умеренный

Умеренный бесцветный

Овсяно-мучная

Бесцветная

Физиологические признаки. Растет при

18 — 37 С, 5Келатину не разжижает при 10 ,18 С. Крахмал не гидролизует. Коагулирует молоко при 25 С 7 дней; при 37 С молоко не коагулирует.

На тирозин-агаровой среде меланьи не образует.

На пептон-железоагаровой среде не растет.

Нитраты не восстанавливает.

Отношение к источникам углерода. Данные об усвоении источника углерода на агаровой среде приведены ниже (+ усваивает, — не усваивает): ка азота, например, дрожжевой эистракй, кукурузный экстракт; распительный белок, семенной белок, гидролизаты таких белков, гидролизаты молочного белка, рыбные и мясные экстракты и гидролизаты, например, пептоны. Можно использовать также химические источники азота: мочевину, со-" ли аммония, амиды; аминокислоты или их смеси; найример, валин, аспарагин, глута- миновую кислоту, пролин и фенилаланин.

В питательную среду можно вводить углеводы (0,1 — 5%). Можно также применять крахмал или гидролизаты краЖМала, напрымер; декстрин, сахарозу, лактозу или другие сахара, или глицерин или его сложные эфиры. Источники углерода могут быть производными растительных масел или жиров животного проксхождения. В качестве источника углерода для роста и получения ингибит6ров беталаитамозы можно вводить карбитовые кислоты и их соли.

Для регулирюванмя пенообразования не "которых сред в ферментерах необходимо добавлять антипенные прысадки, например, «Плюроник 1 81», К среде, описанной выше, можно добавлять минеральные соли, например, хлориЛ-арабиноза +

Д-ксилоза

Д-глюкоза +

Д-галактоза +

Д-манноза +

Д-фруктоза

Л-рамйоза + .

Сахар +

Лак поза

Целлобиоза

Трехалоза

Раффиноза

Инсулин

Инозит

Д-маннит

30

Питательная среда; -которую можно применять для культивирования Streptomyces j umon/inensis, может содержать 0,1 — Зб 10% комплексного органического источни695565

Табл.ица 2 — т.ф

Диаметр зоны (лл) при продолжительности ! ферментации, сутки

Антибактериальная активность в отношен

17,4

KIebsiella аегодепез

20,5

26,8

NAG

37;1

46 0,72 в системе бутанол — уксусная кисло та — вода и при Р/ 0,25 в системе бутанол — этанол — вода. Величины Я/ оди7

Бакто-декстроза (Дифко) 4,0

Растворяют в,дистиллированной воде, доводят до рН 7,3, а затем добавляют

20 г/л бакто-агара.

Проросшие микроорганизмы, взятые с пбверхности этого агара, используют непосредственно для инокулирования 100 мл посевной среды, содержащейся в 500 мл конических колбах; закрытых пробка ми из пенопласта. Состав посевной среды, г/л;

Триптон (оксоид), . 5,0

Дрожжевой экстракт 3,0

Среду стерилизуют перед онокулированием путем выдерживания в автоклаве под" давлением 1,055 кГ/см2 при 121 С 15 мин.

Микроорганизмы после посева выдерживают в термостате прои 26 С 65 ч на ро- торном вибраторе при 240 об/мин.

Порции по 5 мл посевной среды используют для инокуляции порций по 100 мл ® ферментативной среды, содержащейся в конических колбах емкостью 500 мл, закрытых пробками из пенопласта.

Используют три разные ферментативные среды следующего состава, г/л:

А. Глюкоза 20,000

Соевая мука 10,000 CaCOs 0;200

, Na2SO4 0,500

СоС1 РО4 . 6НзО 0,001 ™

Разбавляют дистилл ирюванной водой. Б. Декстрин, 55,0

Соевая мука, 20,0

Мел асса 20,0

NaH PO4 1,3 35

КС1 10 -

Разбавляют дистиллйрованной водой.

Образцы на четвертый день фермента= ции наносят в виде пятна на полосу хро. матографической бумаги (ватман № 1) ши; риной 1 см. Эти полосы подвергают хроматографии в течение ночи нри 4 С в следу ющей системе растворителей: . н-бутанол †этанол †4: 1: 5 .(по объему; легкая фаза);

4 и-бутанол — уксусная кислота — вода

12: 3: 5 (по объему).

Ленты высушивают и кладут на чашки с агаром, засеянным Klebsiella aегоgenes

NCTC 418 к содержащим пенициллин G @» (пластины KAG). После выдерживания чашек в термостате в течение 16 ч при 28 С просматривают зоны ингибирования роста.

В. Дрожжевой экстракт (оксоид) 10

Скотазол 20

Разбавляют дистиллированной. водой. Доводят значение рН до 7 перед стерилизацией.

Все фер ментативные среды стерилизуют перед засевом в автоклаве под давлением

1,055 кГ/см2 при 121 С 15 мин. Колбы для ферментацви выдерживают в термостате при 26 С на роторном вибраторе при

240 об/мин.,Образцы по 5 мл удаляют из ферментационных колб в стерильных условиях на второй день ферментации и обрабатывают следующим образом. Образцы центр ифугируют при 2200 g 10 мин и верхний слой сохраняют. Верхний слой обладает ингибиторной активностью в .отношении препарата бета-лактамазы (E. coli JT4) с применейием стандартной»методики определения инпибирован ия бета-лактамазы.

Пример 2. Str. /umon/iriensis NRRL

5741 выращивают в среде А, описанной в примере 1. Образцы подвергают через определенные интервалы процессу ферментации в стерильных условиях. Верхний слой получают центрифугированием этих образцов при 2200 g за 10 мин и подвергают анализу на антибактериальную активность по отношению к К1ебие11а аегодепез, а с применением диффузии пластинчатого агара с отверстием — и на активность по отношению к агаровой системе КАб (1), Результаты анализов приведены в табл. 2.

В обеих системах растворителей наблюдается. одна зона ингибирования при Ry иаковы с Rf идентичных клавулановых кислот, прошедппих испытания в такой же системе.

Пример 3. Streptomyces jumonjinensis NRRL 5741 выращивают 7 дней при

26 С на твердом косом агаре, помещенном в бутыли. В качестве агаровой среды используют бакто-дрожжевой агар, содержащий солодовый экстракт.

В бутыли вводят 100 мл стерильной деионизированной воды, содержащей 0,05%

695565

55

10,0

5 стый натрий, хлористый калий, хлористый магний, хлористый цинк, хлорное железо, сульфат натрия, сульфат двухвалентного железа, сульфат магния, а также натриевые или калиевые соли фосфорной кислоты; в качестве источника ионов двухвалентного кальция или для создания буфера можно вводить карбонат кальция. Можно также включать соли микроэлементов, например, никеля, кобальта или марганца. При желании можно добавлять витамины.

ИспоЛьзуемый в данном тексте термин

«мутант» означает любой мутантный штамм, который повышает спонтанно или беспрепятственно влияние йаружного средства независимо от того, вводится ли это средство умышленно или иным образом.

Культивирование Streptomyces jumonjinensis обычно проводят при 16 — 35 С или 25 — 30 С, в частности при 27 С, и рН от 5 до 8,5, предпочтительно от 6 до 7,5.

Культивировать можно в сосудах (в стеклянных конических колбах) при перемешиван ии (при взбалтывании на роторном вибраторе) или в аэрированных ферментерах, например, в ферментерах из нержавеюгдей стали, снабженных перегородками, в которых перемешивание осуществляют с помощью лопастных дисковых импеллеров, а аэрирование — с помощью барботеров.

Ферментацию можно также осуществлять непрерывно.

Исходное значение рН процесса ферментации обычно составляет 7,0, а максимальный выход клавулановой кислоты получают при 20 — 32 С в течение 1 — 10 дней, преимущественно 2 — 5 дней.

Перед выделением клавулановой кислоты; и ее.солей из ферментационной среды сначала удаляют клетки Str. jumonjinensis

ИК1<1 5741 фильтрованием или центрифугированием.

Далее культуральную жидкость охлаждают, например, от 0 до — 5 С, доводят значение рН до 2 — 3 и экстрагируют из нее клавулановую кислоту сначала органическим растворителем, не смешивающимся с водой, а затем водным раствором бикарбоната натрия, буферным раствором гидрофосфата калия, карбонатом калия или водой при нейтральном значении рН.

Клавулановую кислоту из культуральной жидкости можно экстрагировать такФе смесью органического растворителя и водонерастворимого щелочного металла, например, лития.

Вы<деление солей клавуланозой кислоты осуществляют путем использования ионообменной хроматографии на колонках.

Культуральную жидкость пропускают через смолу," имеющую полиалкиновые или четвертичноаммониевые группы, до насыщения смолы клавулановой кислотой с rioследующйм элюированием соли водным солевым раствором, особенно с использова1.

6 нием «Изопора», «Деацидита FFIP SPA64» или «ДЕАЕ-целлюлозы».

Колонку, заполненную «Деацидитом», можно постепенно элюирова ть водным ра5 створом соли, например, хлористого натрия (0,5М) . Колонку с «ДЕАЕ-целлюлозой» в 0,01М фосфатном буфере при рН 7 можно элюировать раствором хлорида щелочного металла, например, хлористого на10 трия 0,2М в 0,01М фосфатном буфере.

Выделение солей клавулановой кислоты проводят также путем пропуска ния культуральной жидкости через угольнв и слой с последующей промывкой фильтрата водой и элюированием ацетоном.

Активные фракции определяют по их активности ингибирования бета-лактамазы и по их активности в отношении системы

NAG I1).

Полученные активные фракции соединяют, концентрируют до небольшого объема под вакуумом и обвссоливают.

Отделение клавулановой кислоты и/или ее солей от неорганических солей и други;.

25 примесей можно осуществить путем адсорбции антибактериальных средств линофильной смолой, на которой неорганические соли не адсорбируются, например, сополимером полистирола с дивинилбензолом ти па «Амберлит ХАД-4».

Целевой антибиотик можно удалять из колонки элюированием. Элюирование осуществляют водой ил и водным алканолом, и полученный раствор концентрируют упариЗ5 ванием и лиофильной сушкой до получения материала улучшенного качества. Отделение клавулановой кислоты и/или ее солей от неорганических солей можно также с успехом осуществлять хроматографией на колонке, заполненной средством для фильтрования через гель, например, сшитыми декстрановыми гелями, такими, как «Сефадекс G 15» и полиакриламидными гелями типа «Биогель Р2».

Активный обессоленный материал можно подвергать дальнейшей очистке хроматографией, например, на колонке, заполненной целлюлозой, с применением водноспиртовой системы растворителей, например, системы бутанол — этанол †. вода в объемном соотношении 4: 1: 5 в качестве легкой фазы.

Клавулановая кислота или ее соль, получаемые при таких реакциях, обладают хорошей степенью чистоты, например, не менее 93%.

Пример 1. Strepfomyces j umonjinensis, ЖЯК1 5741 выращивают в течение 7 дней на твердом косом агаре следующего состава, г/л:

Бакто-дрожжевой экстракт (Дифко) 4,0

Быто-солодовый экстракт (Дифко) 695565

Тритона Х (поверхностно-активное веще- ство), производят соскоб с поверхностй

Культуры и получают суспензию опор и мицелия. 100 мл суспензии используют" для посева среды 50 л, содержащейся в ферментере яз нержавеющей стали с перего° родками общей мощностью 90 л.

Применяют посевную среду следующего состава, г/л:

Триптом (оксоид) 5,0

Дрожжевой экстракт (оксо ид) 3,0

Антипенный агент 0,5

Разбавление производйт водопроводной водой.

Антипенный агент состоит из 10 «Плюроник L81» («Южин Кулманн Кемикэлс

Лтд.»), диспергированного в соевом масле («Бритиш Ойл энд Кэйк Миллс»).

Перед посевом среду стерилизуют паром в ферментере. После посева продукт перемешивают с применением лопастной дисковой мешалки диаметром 12,7 см, вращающейся со скоростью 240 об/мин, подают стерильный воздух оо скоростью 50 л/мин и поддерживают температуру 26 C-.- Рост посевной культуры продолжается 48 ч.

7,5 л полученного продукта используют для засева 150 л ферментативной среды, содержащейся в ферментере из нержавеющей стали емкостью 300 л, имеющем перегородки.

На стадии ферментации применяют среду следующего состава, г/л:

Моногидрат глюкозы 20,000

Соевая мука 10,000

СаСОЗ 0,200

Со С 12 6Н20 0,001

iNa SO4 0,500

Антипенный агент 0,500

Разбавляют водопроводной водой.

Анпипенный агент- исйользуют такой же, каК в среде для засева.

Среду стерилизуют паром в ферментере перед засевом. После засева ферментативную среду перемешивают с применением лопастной дисковой мешалки диаметром

21 см, работающей со скорюстью 340 об/мин, вводят стерильный воздух со скоростью

150 л/мин и поддерживают температуру

26 С в течение ферментации, проводимой

72 ч.

Цельный отвар осветляют центрифугированием. Осветленный отвар 140 л доводят . до рН 6,2, пропускают через сильноосновную анионообменную смолу «Церолит FF»

SRA 61 (15х30 см) со скоростью 500 мл/мин.

Колонку промывают .охлажденнюй деминерализованной водой (15 л) со скоростью потока 500 мл/мин, а затем элюируют охлажденным 1М раствором хлористого натрия с такой же скоростью потока и собирают фракции 4 л. Фракции просматривают с применением нулевого положейия в мето - дике биоанализа в чашках аистемы KAG.

Фракции (2 — 19), показывающие хорошую активность на системе KAG, соединяют. Доводят значение рН соединенных фракций до

6,2, затем фракции юхлаждают и пропуска- ют через колонку с «Амберлитом ХАД-4» (ЗОх125 см) со скоростью 500 мл/мин. Колонку промывают охлажденным 1М раствором хлор истого натрия (5 л), а затем элюируют деминерализованной водой при 5 С со скоростью 500 мл/мин. Фракции 5 л собирают, начиная непосредственно перед полным элюированием хлористого натрия

15 из колонки. Фракции 3 — 9, содержащие клавулановую иислоту, соединяют.

Соединенные фракции 35 л концентрируют путем 10-кратного юбратимого осмоса.

Рециркулируют остаточный продукт из

20 емкости, выполненной из нержавеющей стали, снабженной охлаждающей системой с наружным клапаном, ведущим к установке для ультрафильтрования, с получением разности давлений для 40 (мембран составляющей 45 атм. Поддерживают температуру 2 — 5 С рН 6,8+.0,1 добавлением 2 н. раствора соляной кислоты. Полученный концентрат (3,5 л) высушивают с получением бурого аморфного твердого вещества (34 г).

2 г материала, полученного как описано выше, растворяют в 25 мл дистиллированнюй воды и наносят на слой размером

38 ммр 406 мм пермутитовой смолы FFIP эб (SRA 62) в виде хлорида. Колонку элюируют цутем гравитационной подачи 0,5М хлористого натрия в омесительный резервуар с 1 л дистиллированной воды, откуда

его подают в хроматографическую колон40 ку. Собирают 10 мл пробы и определяют

Р-лактамазную ингибиторную активность, используя 1/2500 разбавление фракций. Активность элюируют после основной полосы цвета между фракциями 24 и 30, Активные

45 фракции смешивают и." концентрируют до

30 мл. Этот раствор обессоливают, испюльзуя слой — 51 ммх457 мм из биюрад биогеля;и элюируют 1% и-бутанолом в воде.

20 мл фракции исследуют на содержание клавулановой кислоты, используя определе. ние ингибирования Р-лактамазы. Фракции также наносят в виде пятен на бумажные полости и опрыскивают либо реагентом

Эрлиха, либо трифенилтетразолевым реагентом, при этом Р-лактамазная ингибиторная акпивноеть коррелирует с разовыми или с красными пятнамы соответственно, даваемыми этими реагентами. Активные фракции смешивают, исключая те, которые содержат

6О хлористый натрий, и концентрируют под вакуумом, получая частично очищенную натриевую соль клавулановой кислоты.

Тонкослойная хроматография (силикагель) этого препарата клавулановой кислоты дает следующие значения R . и-бута695565

11 нол — этанол — вода 4: 1: 5 (объем/объем) верхняя фаза — 0,37; н-бутанол — уксусная кислота — вода 12: 3: 5 (объем/ объем) — 0,44; изопропанол — вода 7: 3 (объем/объем) — 0,78. Зоны выявляют путем опрыскивания реагентом Эрлиха.

6-Аминопенициллановая фракция имеет зйачения Rt 0,38, 0,39,и 0,77.

Величину Rt сравнивают с величиной

Rt идентичного бензилклавуланата, хроматографируемого в таких же условиях (реак- тив — хлористый трифенилтетразолий— приготовляют смешиванием 1 ч. 4% -ного . раствора хлористого тр ифенилтетразолия в метаноле с 1 ч. 1 н. раствора едкой щелочи).

Фракции 30 — 45, содержащие бензилклавуланат, соединяют и упаривают .при пониженном давлении с получением маслянистого остатка. 20

Продукт, пропущенный через колонку с

«Сефадексом LH 20», рас творог к минимальном количестве смеси циклогексана с этнлацетатом (1: 1) и "прогф ают через колонку (2,5х28 см) и оиликагелем, при- 25 годным для тонкослойной хдоматографии, подготовлейную с помощью такого же растворителя. Колойку-элюируют смесью цикло гексана с этилацетатом (1: 1) и 28 фракций объемом.7 мл собирают с последующим об- ао разованием фракций IIG 15 лл. Фракции

31 — 33; дающие красное окрашивание при

" нанесении на силикагелевые пластины для тонкослойной хроматографии с последую- щей обработкой реактивом хлористым три- 35 фенилтетразолием, соединяют и упаривают при пониженном давлении. г

Полученное масло подвергают ЯМР- и

ИК-спектроскопии. Получают спектры, идентичные полученным для стандартного 40 образца бензилклавуланата. "=-="---! ! !

Формула изобретения

1. Способ получения квавулановой кис- 45 лоты и ее солей путем выращивайия йродуцирующих ее микроорганизмов рода 5trep.

tomyces на питательной среде в присутст. вии источников углерода, азота и необходимых минеральных солей с последующим выделением и очисткой целевых продуктов, отл и ч аю щи и ся тем, чтьо, с целью по« вышения чистоты получаемых продуктов, в качестве продуцента используют штамм

Streptomyces jumonjnensis МЯКИН 5741:

2. Способ по п. 1; отличающийся тем, что перед выделениеМ культуральную жидкость охлаждают, доводят значение рН до 2 — 3 и экстрагируют из нее клавулановую кислоту сначала органическим растворителем, несмешивающимися с водой, а за. тем водным раствором бикарбоната натрия, буферным раствором гидрофосфата калия, карбонатом калия или водой при нейтральном значении рН.

3. Способ по п. 1, отлич а ющийся тем, что перед выделением из, культуральной жидкости экстрагируют клавулановую кислоту смесью органического растворителя IH водбнерастворимого амина, а затеМ водным раствором соли щелочного металла.

4. Способ по и. 1, отличающийся тем, что выделение солей квавула новой кислоты осуществляют путем пропускания культуральной жидкости через смолу, имеющую полиалкиновые или четвертичноаммониевые группы, до насыщения смолы клавулановой кислотой с последующим элюированием соли водным солевым раствором, 5. Способ по п. f, отличающийся тем, что выделение солей клавулановой кислоты проводят путем пропускания культуральной жидкости через угольный слой с последующей про;мывкой фильтрата водой и элюированием ацетатом.

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:

1! Патент Бельгии № 827926, кл. С 07 d, оп!ублйк. 1974.

I ! фЬ.="- -.

Составитель А. Бражникова Редактор Н. Хубларова Текред А. Камышников!а Корректор С. Файн

Заказ 1209/1505 - Изл. "№ 655 Тираж 549 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035з Москва, 7К-35, Раушская Йаб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент»