Штамм 2а-продуцент фермента -1,3/1,4-глюкан- глюканогидролазы

Штамм 2а-продуцент фермента -1,3/1,4-глюкан- глюканогидролазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

- а(phd

r ..-, Г t

> е с

ОП ИСА И"E

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистическик

Республик

,н

«»696055

; Ъ ,/

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 040477(21) 24ь9б52/28-13 (51)М. Кл. с присоединением заявки йо

С 12 К 1/02

С 12 D 13/10

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (23) Приоритет (53) УДК 663,18 (088.8) Опубликоаано 05.11.79. бюллетень Mо 41

Дата опу6ликоаанил описания 05.117 9 (72) Авторы изобретения

Н.А, Заикина, Н.П. Елинов, Л.ф. Ревот и H.E. Седова

Ленинградский химико-фармацевтический институт (71) Заявитель (54) UITAMM ACTlNOMYCES NARB0NENS1$2а-ПРОДУЦЕНТ

ФЕРМЕНТА И-- 1, 3/1, 4- JHOKAfl-ГЛЮКАНОГИДРОЛАЗЫ

Изобретение относится к пройзвод. ству ферментных препаратов с помощью микроорганизмов и представляет собою новый шамм актиномицета, используемый для получения фермента — 1,3/

1,4-глюкан-глюканогидролаэы (бетаглюканазы) . Известны различные микроорганизмы - продуценты бета-глюканаз.

Однако они продуцируют бета-глюканазу 10 в комплексе с другими ферментами,что существенно затрудняет выделение и очистку специфического фермента (1).

Целью изобретения является штамм

Actinomyces: narbonensis 2а, который продуцирует специфический фермент беэ примесей других гликозидаэ, что значительно облегчает очистку фермента.

Полученный штамм Actinomyces

narbonensis 2а имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики.

Морфологические признаки.

Образует прямые удлиненные спороносцы, расположенные в виде метелок или пучков .

Споры овальные, продолговатые с гладн AA оболочкой .

Среда Чапека с крахмалом! воздушный мицелий белый, мучнистый. Субстратный мицелий желтый до бежевого.

Среда Гауэе II: воздушный мицелий белый, субстратный-желтый.

Овсяный агар п6 Ваксману: воздушный,мицелий светло-серый„ субстратный — бежевый.

Крахмально-аммиачная среда: воздушный мицелий розовый, субстратный желтый.

На жидкой среде без встряхивания поверхностный рост, приводящий к образованию мицелиальной пленки . физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Оптимальная температура роста 28-30 С, Оптимум рН 8,8-7,2.

Молоко пентонизирует, желатин разжижает, крахмал не гидролиэует, нитраты редуцирует, клетчатку не разлагает.

Ассимилирует углеводы: глюкозу, сахароэу, мальтозу, лактоэу, галактозу, арабинозу, крахмал..

Меланоидов не образует.

В присутствии Р -1,3 связанного глюкана в качестве индуктора продуцирует фермент р-1,3/1,4-глюканглюканогидролаэу.

696055

Антагонистические, свойства.

ПоДавляйт" рост Saccharomyces

cerevisiae ToruIa ." ituIis. Не подавляет St. aureus 209 Р, Е.coIi,Âàñ,SubtiIis, Mycobacterium Sp. И=5, AspergiIIus niger, Fisarium soIani.

Пример. получения продуцента, фермента.

В Лейинградской области бйли собраны 50"образцов почвы, их суспенди- ровали в равном количестве воды (вес:объем), взбалтывали 15 мин, давали отстояться 5 мин., надосадочную жидкость в количестве 0,2 мл засевали газоном на чашки Петри с модифицированным arapoM Чапека, содержащим в качестве .единственного источника углерода бета-структурированный глюкан. Состав среды (г/л): NANO>- 3,0

К НРО+- 1,0; М(БО„- 0,5;KCl — 0,5;

FeSO+ — ;глюкан — 3,0;.агар-агар

2О,О.Выращивание 3-5 дней при 24 С.

Отбирали наиболее активно растущие колонии и рассеивали их на среду тако.го же состава. Операцию повторяли 35 раз до выделения чистой культуры. 25

Полученные штаммы проверяли на способность выделять фермент в культу. ральную среду.Для этого их засевали, в жидкую среду,по солевому составу не отличающуюся от приведенной выше, !.,0 но содержащую ЗЪ сахароэы и О,ОЗЪ глюкана в качестве индуктора.Выращивали

Наименование субс

86+18

Ламинарии

Шизофилан

Пуллулан глюкан

$-1,З и р-1,3, d.-1,4 и

49+10

19+5

0 (-1,6!

-„(-l, 6

Крахмал ! Гликоген

То же р-1,3 и

Полисахарид

)Ь-l, 4 маннан

RhodotoruIa

rubra

Поли сахарид!

dа-1, 3

Cryptococcus

IaurenИ.i!

-.(.-1,2 и < (-1,6

4+0,5

4- р-глюкозидглюкоза Р-1,4

4- -галактоэидглюкоэа р-1,4

1- aL,-глюкозидглюкоза (.-1,1

Целлобиоза

Лактоэа

Трегалоза

0. Полисахарид / Candida аХЫсапэ в колбах на качалках. Активность фер-мента в культуральной жидкости определяли вискозиметрически.Иэ активной культуральной жидкости фермент высаливали сульфатом аммония при насыщении 0,6,избыток соли удаляли диализом в фосфатном или ацетатном буфере, рН которого соответствовал рН культуральной жидкости. Диализованный фермент использовали для изучения его субстратной специфичности (табл.).

В качестве субстратов были взяты полисахариды с различной химической структурой. Активность ферментов определяли по приросту редуцирующих саха-,, ров методом Хаггедорна-Йенсена. За единицу активности принимали то количество фермента, которое в условиях опыта вызывает образование 1 мкг 1 редуцирующих веществ (в пересчете на глюкозу) за 1 ч. Отбирали только те штаимы, которые продуцировали бетаглюканаэу и не образовывали других гликозидаз, которые могли бы затруднить дальнейшую очистку специфического фермента. Таким образом был отобран штамм актиномицета 2а. Изучение гидролиэа полисахаридов, имеющих различную химическую структуру, ферментом, продуцируемым этим микроорганизмом, показывает, что данный фермент является высокоспецифичным в отношении р --1,3/1,4 связанных глюканов.

696055

Формула изобретения

Составитель И. Привалова

Редактор Н. рязнова

Н. Г а Техред М Келемеш Корректбр Н. Задерновская

Тираж 526 ПодййСйое

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 6704/27

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Характеристика фермента °

При выращивании в описанных выше условиях выход фермента с 1 л культуральной жидкости составляет в сред- нем 20 мл раствора с активностью

80 ед/мл с использованием в качестве субстрата ламинарина. Оптимум рН

6,0 температурный оптимум 37 С. Фермент сохраняет активность при хранении в ацетатном буфере при рН 6,0 и температуре 5 С в течение 10 дней. 10

В лиофилизованном состоянии в запаянных ампулах сохраняет активность в течение 2 месяцев. При рН 2,5 за

1 ч теряет 70% своей активности, при рН 8,5 эа то же время утрачивает 55% активности, Штамм Actinomyces narbonensis 2а - 20 .продуцент фермента p — 1,3/1,4 глюкан-глюканогидролазы, Хранится в коллекции Ленинградского химико-фармацевтического института. 25

Морфологические признаки, Образует

"прямые удлиненные спороносцы, расположенные в виде метелок или пучков. Споры овальные, продолговатые с гладкой оболочкой. На среде Чапека 3О с крахмалом воздушный мицелий белый, мучнистый. Субстратный мицелий желтый до бежевого. На среде Гаузе

II воздушный мицелий белый, субстратный-желтый.На овсяном агаре по Ваксману воздушный мицелий светло-серый, субстратный — бежевый.На крахмало-аммиачной среде воздушный мицелий розо-. вый, .субстратный — желтый. На жидкой среде без встряхивания поверхностный рост с образованием мицелиальной пленки, Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Оптимальная температура роста 28-30 С. Оптимум 6,8-7,2. Молоко пептониэирует, желатин разжижает, крахмал гидролизует, нитраты редуцирует, клетчатку не разлагает. Ассимилирует углеводы: глюкозу, сахаро. эу, мальтозу, лактоэу, галактозу, арабинозу, крахмал.

В присутствии -1,3 связанного глюкана в качестве индуктора продуцирует фермент,p — 1,3/1,4-глюканглюканогидролазу.

Антагонистические свойства. Подавляет рост Saccharomyces cerevisiae, ToruIa utiIis.

Не подавляет StaphyIococcus aureus 209.P, Escherichia coIi, BaciIIus

subtiIis, Nycobacterium sp. B=5, AspergiIIus niger, Fusarium soIani.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Франции Р 2173089 кл. С 12 D 13/00, опублик. 1972.