Способ определения целлюлолитической активности ферментов

Способ определения целлюлолитической активности ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскип

Социалистических

Ресттубпик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. санд-ву

{22) Заявлено 06.07.77 (21) 2504398/23-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет (51)М. Кл.

G 0I N 33/14

Геоударстеепный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 05,11,79 Бюллетень ле 41

Дата опубликования описания 05.11.79 (53) УД К577.151 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. Л. Яровенко, А, П. Рухлядева и Г. В. Полыгалина

Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

ЦА 0 953 С + 0 0088 и

Изобретение относится к спиртовой промышленности, а именно к способу определения активности целлюлолнтических ферментов, гидролизующих некрахмалистую часть углеводов зернового сырья при производстве спирта, 5

Известен способ определения целлюлолитической активности ферментов путем фермен- тативного гидролнэа целлюлозосодержащего субстрата, инкубации анализируемой и контрольной проб, инактнвацни фермента в аналнзируе10 мой пробе,. фильтрации, введения реактива, колориметрирования и расчета целлюлолитической активности (1).

Недостатком данного способа является то, что используемые субстраты содержат наряду

15 с целлюлозой ряд примесей, в том.числе и гемицеллюлозу, которая гидролизуется целлюлолитическими ферментами также до углеводов. Следовательно, полученное этим методом содержание углеводов не будет соответствовать истинному, образуюгцемуся в результате гидролиэа чистой целлюлозы.

Целью настоящего изобретения является повышение точности и упрощение процесса.

Это достигается тем, что в качестве целлюлозосодержащего субстрата используют оболочки овса, предварительно измельченные и осво. божденные от гемицеллюлоз, после ферментативного гидролиза иэ гидролизатов осаждают высокомолекулярные углеводы, а в качестве реактива ислольэуют антроновый реагент, при этом после колориметрирования определяют количество сбраживаемых спирторастворимых углеводов, а расчет целлюлолитической активности ведут по формуле: где ЦА — целлюлолитическая активность, ед/г;

С вЂ” содержание спирторастворимых углеводов, г;

n — содержание ферментного препарата в реакционной среде, г;

0,953 и 0,0088 — постоянные расчетные ко-, эффициенты.

Способ заключается в следующем, Целлюлозный субстрат получают иэ оболочек овса путем размалывания на вибромель696377!

О нице до порошкообразного состояния (проход через сито с диаметром отверстий. 0,25 мм).

Полученный порошок подвергают кислотному гидролиэу 2%-ным раствором HCI в колбе, снабженной обратным холодильником, в течеwe 5 ч при непрерывном помешивании и подогреве на магнитной мешалке или водяной бане. Порошок промывают дистиллированной водой на стеклянном фильтре до исчезновения кислой реакции. Для отделения гемицеллюлозы из полученного порошка проводят обработку его 8 объемами 4%-ного раствора NaOH в течение 2 ч при периодическом помешивании в стакане. Затем содержимое стакана центрифугируют и осадок промывают горячей дистиллированной водой до исчезновения щелочной реакции; порошок высушивают при

37 С и используют н качестве субстрата.

В стаканчик размером 2,5 х 6,0 см помещают 100 мл субстрата, приливают 5 мл ферментного раствора и 2 мл ацетатного буфера с рН 4,7. Содержимое стаканчика инкубируют в течение 60 мин при 50 С, затем выдерживают в кипящей водяной бане в течение

l0 мин для инактивации, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр.

Контрольную пробу готовят аналогично испытуемой, используя предварительно инактивированный ферментный раствор.

В полученных фильтратах определяют спирторастворимые углеводы. Лля этого 1 мл фильтрата помещают в мерную колбу емкостью

25 мл и приливают до метки этиловый спирт для осаждения высокомолекулярных углеводов. Содержимое колбы перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Затем в пробирки с притертыми пробками наливают по 5 мп антронового реагента и осторожно по стенкам пробирки приливают по

2,5 мл исследуемого и контрольного cIINpfoвых фильтратов. Энергично перемешивают и выдерживают в кипящей водяной бане в течение 6 мин. Затем содержимое пробирок охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют ха ФЭК--56M в кювете с длиной грани 5 мм с использованием светофильтров

Л = 597 нм и Л = 440 им.

Содержание углеводов рассчитывают по специальному уравнению, выведенном> на основании экспериментальных данных зависимости оптической плотности от количества глюкозы в стандартных растворах, которое имеет вид:

С = (14,28 01 -- 20,77 Р ) и г/100 мл, где С вЂ” содержание спирторастворимых углеводов, г/100 мл;

Р— оптическая плотность при Л = 597 нм;!

Рр — оптическая плотность при Л = 440 нм;

14, 28 и 20,77 — постоянные расчетные коэффициентыы, п — коэффициент разведения.

14еллюлолитическую активность определяют по расчетному уравнению, выведенному на ос-, новации зависимости количества образовавшихся в результате ферментативной реакции угле-! водов от количества единиц активности, введенных в реакцию.

За единицу активности принято такое количество фермента, которое в стандартных условиях гидролизует до сбраживаемых углеводов

1 мг целлюлозы, составляющий 0,4% от введенного в ферментативную реакцию количества целлюлозы.

Пример выполнения способа.

Лля анализа взят ферментный препарат целлокандин ГЗХ в количестве 100 мг/100 мл дистиллированной воды. Из этого раствора приготовлен рабочий раствор, содержащий 0,35 мг фермента в 1 мл раствора.

В стаканчик помещают 100 мг субстрата, полученного из оболочек овса вышеуказанным методом, 5 мл рабочего ферментного раствора и 2 мл ацетатного буфера с рН 4,7, Аналогично готовят контрольную пробу, используя инактивированный рабочий ферментный раствор.

Содержимое стаканчиков инкубируют при

50 С в течение 60 мин. Затем исследуемую пробу выдерживают в термостате в течение 7—

10 мин в кипящей водяной бане для инактивации фермента. Обе пробы фильтруют через бумажный фильтр.

В две мерные колбы емкостью 25 мл приливают по 1 мл фильтратов и доводят до метки 96%-ным этиловым спиртом. Выпавший ocRдок высокомолекулярных углеводов отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр и в фильтратах определяют содержание спирторастворимых углеводов, Лля этого в пробирки с притертыми пробками наливают по 5 мл антронового реагента и по 2,5 мл спиртовых фильтратов. Содержимое.энергично перемешивают и выдерживают в течение 6 мин в кипящей водяной бане. Пробы охлаждают и колориметрируют на ФЭК-56М в кюветах с длиной грани 5 мм и со светофильтрами с Л = 597 нм н Л = 440 нм.

Получили, что Р! = 0,320. а Рг = 0,060.

Подставляя полученные величины оптических плотностей в расчетное уравнение, получают содержание спирторастворимых углеводов:

С = (14,28 0,320 — 20,77 0,06) 0,875 =

= 2,90 мг, где 0,875 — коэффициент разбавления.

6«377

0,0017

ЦА 0,953 С + 0,0088 ед/г и где ЦА—

С—

20 0,953 и

Составитель В. Ершова

Техред Л,Алферова Корректор А Гриценко

Редактор H. Грязнова

Заказ 6758/45

Тираж 1073 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж--35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Подставляя полученное содержание спирторастворимых утлеводов в расчетное уравнение, получаем целлюлолитическую активность:

0,953 2,90 + 0,0088

ЦА = = 163,08 ед/г где 0,0017 — содержание ферментного препарата в реакционной среде, рассчитанное в зависимости от его количества, взятого на анализ на 100 мл воды. Использование предлагаемого способа позволит повысить точность определения целлюлолитической активности фермента.

Формула изобретения

Способ определения целлюлолитической активности ферментов путем ферментативного гидролиза целлюлозосодержашего субстрата, инкубации анализируемой и контрольной проб, инактивации фермента в анализируемой пробе, фильтрации, введения реактива, колориметрирования и расчета целлюлолитической актив> ности, отличаю шийся тем,что, с целью повышения точности и упрощения процесса, в качестве целлюлоэосодержащего субстрата используют оболочки овса, предварительно измельченные и освобожденные от крахмала и гемицеллюлоз, после ферментативiÿãî гидролиза из гидролизатов осаждают высокомолекулярные углеводы, а в качестве реактива используют антроновый реагент, при этом после колориметрирования определяют количество сбраживаемых спирторастворимых утлеводов, а расчет целлюлолитической активности ведут по формуле: целлюлолитическая активность, eg/ã; содержание спирторастворимых углеводов, г; содержание ферментного препарата в реакционной среде, г, 0,0088 — постоянные расчетные. коэффициенты.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2 1. Фениксова P. В. Методы современной биохимии, 1975, с. 23 — 25.