Способ получения антибиотического комплекса лизолипина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

С " « - Ъ

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистическиx

Рвспубпик

< Ж97056 (6E) Дополнительный к патенгу (22) Заявлено 1805.76 (21) 2357857/28-13 (23) Приоритет — (32) 20,05. 75 (3E) 6477/75 (ЗЗ) Швейцария (53) М. Кл.

С 12 D 9/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 05.1179.Бюллетень,% 41 (53) УМ(615. 779, .931 (088. 8) Дата опубликования описания 05.1179 (72) Авторы Иностранцы

ИЗОбрЕтЕИИя ХаНс ценер (Швейцария), Ханнелоре драуц (ФРГ) и Вальтер Келлер (Швейцария) Иностранная фирма юЦиба-Гейги АГ™ (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА ЛИЗОЛИПИНА

0 О

ОЙ1

Антибиотический комплекс лизоли5 пина является новым и способ его получения в патентной литературе не описан.

НО,Н 0

Целью изобретения является получение антибиотического комплекса лизолипина, включающего лизолипин формулы

0 0

НО..

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается производства антибиотиков. и лизолипин х — изомер лизолипина (1) формулы

Эта цель достигается тем, что штамм Streptomyces vioEacea 96 (ИНИ1 8097) выращивают в аэробных

М условиях в течение 3-7 дней на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим отделением комплекса, При необходимости комплекс

3) разделяют на составные компоненты и переводят их в производные.

Штамм Streptomyces via(. aceaniger

Tii 96 (NRRh 8097) депонирован к

Northern Regiona Lab, US-Depart_#_ ment of Agriculture, Pioria,Hfinois и хранится в институте микробиологии

Тюрингенского университета (ФРГ) .

Штамм Streptomycesvio(.aceaniger

Tii 96 образует сперва белый, потом пепельно-серый воздушный мицелий. б 9 7056

Цепи спор разветвлены моноподиально и имеют форму тесных равномерных винтов, которые в большинстве случаев имеют не более чем 3. витка. Споры эллипсоидны, их ширина примерно

0,9.нм и длина примерно 1,2 нм поверх- 5 ность ровная. При росте на содержащих пептон питательных средах (пептонжелезный агар) даже после инкубации в течение нескольких дней не наблюдается меланоидного изменения цвета. Штамм, таким образом, не показывает хромогенности, так как он не может образовать тирозинаэу.

Антибиотик лизолипин получают, выращивая при азробных условиях штамм

Streptomyces vioIaceaniger Tii иЛи образующий лизолипин мутант этого штамма в водном питательном растворе, содержащем источник углерода и азота, а также неорганические соли, пока питательный раствор не покажет значительное антибиотическое действие, и выделяя потом антибиотик лизолипин из культурального фйльтрата. Образующие антибиотик мутанты можно получить, например, 25 при воздействии ультрафиолетовых или рентгеновских лучей или азотистой горчичных масел;

В качестве источников углерода используют, например, ассимилируемые 30 глеводы, например, глюкозу, сахароу, лактозу, маннит, крахмал, глице рин. В качестве содержащих азот питательных веществ используют аминокислоты, пептиды и протеины, а также 35 продукты их разложения„ например пептон или триптон, или мясные экстракты, водорастворимые доли злаковых зерен, например кукурузы и пшеницы, остатков от перегонки при изготовле- 4Q нии алкоголя, дрожжей, бобов, в частности соевых семян, например, хлопчатника и т.д. а также аммониевые соли и нитраты. Питательный раствор может содержать еще другие неорганические соли, например хлориды, карбонаты, сульфаты, фосфаты щелочных или щелочно-земельных металлов, магния, Железа, цинка и марганца.

Выращивание проводят в аэробных условиях, например в покоящейся поверхностной культуре, или, предпочтительно, под водой при взбалтывании или перемешивании с воздухом или 55 кислородом в качалочных колбах или известных ферментерах. Пригодная температура 18-40 С предпочтительно о

27 С. Значительное антибиотическое действие питательный раствор при этомц в общем показывает через 3-7 дней.

Предпочтительно проводят выращивание в некоторых стадиях, т.е. сначала приготовляют одну или некоторые предварительные культуры в жидкой б5 питательной среде, которые потом пвресеивают в собственно продуцирующую среду, например, при соотношении 1:20. Предварительную культуру получают, например, путем пересева, полученного примерно 14-дневным выращиванием на питательной среде мицелия со спорами в жидкую среду и оставляют расти в течение 72 ч.

Антибиотик содержится в культуральном фильтрате. Выделение антибиотика из культурального фильтрата осуществляют по общеизвестным методам, учитывая химические, физические и биологические, в частности, липофильные свойства антибиотика, Из культурального фильтрата можно экстоагировать антибиотик не смешиваемым с водой липофильным растворителем, например уксусным эфиром, углеводородами, такими как циклогексан, бензол, или галогенированными углеводородами, например метиленхлоридом, хлороформом, тетрахлорметаном, тетрахлорэтиленом, Для очистки получаемого после упаривания растворителя сырого продукта можно использовать, например, экстракцию, осаждение, распределение между несмешиваемыми фазами растворителя, или адсорбцию, прежде всего хроматографию, Большую долю более липофильных примесей можно удалять путем экстракции сырого продукта петролейным эфиром. Можно также растворять сырой продукт, например, в метаноле и вьщелять от примесей при помощи адсорбентов, например активного угля, силикагеля, силиката магния, окиси алюминия или их смесей, или адсорбирующих смол, например сшитых декстранов, таких как Сефадекс . Сырой продукт можно очищать, например, путем повторной колоночной хроматографии с применением силикагеля, целесообразно с незначительными добавками активированного угля. Антибиотик элюируют предпочтительно по градиентному способу при помощи смесей хлороформа или тетрахлорметана и метанола, причем ступенчато повышают процентное содержание более полярного растворителя.

Вышеуказанное распределение между несмешиваемыми фазами растворителя можно также осуществлять при помощи противоточного распределения в аппаратуре Крейга. Системой растворителей служит, например, смесь хлороформа, циклогексана, метанола и воды.

Для получения отдельных однородных компонентов антибиотика их разделение и выделение можно осуществлять, например, по методу препаративной тонкослойной хроматографии.

6с} 1056

Таблица 1

ИКТ лизолипина (1) Микро

EubacteriaIes (грамм-отрицательные) (27 ) > 0,0025 (0,005 (37 ) >0,5 <1

Achromobacter geminiani

SaBmoneЮà minnesota

SaEmoneMa typhimurium (37 ) >100 (37 ) >0,001 <0,0025

Proteus vufgaris

EubacteriaIes (грамм-.положительные) (27 ) >0,001

<0 0025

Arthrobacter aurescens

Arthrobacters crystal(opoietes (-.7 ) > 0,001 (Ор 0025

{27 ) -> 0,001 < О i 0025 (37 ) >0,025 < 0,05 (37 ) ) О i001 < 0,0025 (37 ) >0,001 <0,0025 (27 ) > 0,001

<0,0025

C(!ostridium pasteurianum (30 ) ) 0,001 < 0,0025

<0 5 (27 ) >0,1 (27 ) )Oi001 <Ою0025 (27 ) >0,001

<0 0025 (27 ) > 0,001 < 0,0025 (27 ) (27 ) (37 Э

<0,0025

<0 0025

< 0,0025

>0 i00 1

>0 f001

> 0,001

Sarcina Iutea

Staphylococcus aurens

PseudomonadaEes

Pseudomonas f(uorescens

Pseudomonas sacoharophi6a (2 7 о) >0 (}01 (27с ) >0,001

< 0,0025

<0,0025

Более предпочтительным является разделение при помощи колоночной хроматографии, причем в качестве адсорбента применяют, например, силикагель с содержанием 1-5% активированного угля, а элюирование предпочтительно проводят по градиентному способу при -помощи смеси хлороФорма и метанола. Повышение концентрации менее полярного растворителя целесообразно проводить в маленьких процентных степенях, например 5-20В, хлороформа. Можно работать по непрерывному методу градиентного элюирования. Процесс очиArthrobacter simpEex

BaciQ(us brevis

BaciH us megaterium

BaciИцз subti(.is

Brevibacterium f(.ax um

Chromobacterium vioEaceum

Corynebacterium poinsettiae

Corynebacterium rathayi

Micrococcus (,uteus

Nicrococcus rosens

Для лизолипина (Х) МКТ повышается на фактор 10-50.

Компонент (I) лизолипина имеет следующие химические и физические свойства. стки в соответствующем случае можНо повторять

В тонкослойной хроматограмме на плитках силикагвля (силикагель 60, 254) компоненты показывают следующие величины в хлороформе — метаноле (9:1) : Х = 0,58, 1 = 0,81, в бензоле — метаноле (9:1} : Х

0,2б, 1 = 0,30; в хлороформе ацетоне {5:5) ." Х = Oi40i 1 = 0 53} в бензоле — ацетоне (5:5) : Х =

0,47, 1 = 0,74. Для лизолипина (I) в опыте серийного разбавления были найдены следующие минимальные концентрации торможения (МКТ).

Он представляет собой темно-жел-. тое кристаллическое вещество, которое практически нерастворимо в воде и водных кислотах и основаниях, в низших алканолах, например метаноле, 697056

0 0

Ж,О"

0 0

С11 0

5 сн

65 этаноле, н-пропаноле, а также в эфире и петролейном эфире, где оно частично растворяется. Оно хорошо растворяется в ацетоне, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, уксусном эфире, углеводородах, например циклогексане, бенэоле и галогенированных углеводородах.

Лизолипин (I) плавится после кристаллизации из ацетона-эфира при

260-262 С с разложением (cx!) g

-50,2 (хлороформ). При тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ-метанол (1-9:1), Rf составляет 0,6.

Элементный анализ:

Вычислено, Ъ . С 58,25; Н 4,05;

С 5,93; М 2,34,3; ОСН 15,57.

C > H<+CC NP<< (597,95)

Найдейо, Ъ: С 58,36 — 58, 30;

Н 4,22 — 4,27; СГ 6,03; М 2,48

2,38; ОСН 15 р 43. (ОСН вЂ” ойределение по Цейзелю) .

Молекулярный нес, определенный осмометрией давления пара в этилацетате, составляет 536. Микротитрация с 0,1 н, гидроокисью третраметиламмония в метилцеллосольве-ноце (8:2) дает эквивалентный вес 545, Титрация с 0,1 н,.НСС вЂ” нет ступени (таким образом, атом азота не является основным) .

Лизолипин (11 имеет по меньшей мере две ацилируемые гидроксильные группы. Путем более длительного ацетилирования (2 недели при комнатной температуре) получают ди-0-ацетил-лизолипин (I) который кристаллизуют из ацетона-воды. Получают светло-желтые кристаллы н форме призм с точкой плавления 216 †2 С.

Если ацилирование проводят только в течейие ночи, как обычно, то получают смесь двух продуктов, очеви,цно моно- и полиацетат, которые не уцается разделить путем кристаллизации.

В масс-спектре этой смеси сигналы появляются при 683 и 681 мас. ед. со значительно уменьшенной интенсивностью. Путем рентгеновской спектрометрии для компонента Х лизолипяна была найдена следующая структурная

Формула

Лиэолипин (х) получают н виде бес цветного аморфного порошка. Он образует лизолипин при нагревании или при облучении ультрафиолетовым светом, н частности, в присутствии каталитического количества кислоты, Он очень неустойчив н загрязненном состоянии, при хранении на воздухе, в частности при комнатной или повышенной температуре. Не будучи защищенным от влияния света, он постепенно превращается н лизолипин 1.

Частичного разделения лизолипина (Х и I) можно достигнуть распределением в системе тетрахлорметан-хлороформ-метанол-вода (3,4 : 2,28:4:1), Полученный таким образом почти бесцветный аморфный порошок лизолипина можно перекристаллизонывать из метанола. Он разлагается при нагревании, начиная с С, и имеет оптическое вращение (-) ф= †34 1 1 (с = 1,19 в СНС 9 ) . Полученное таким образом чистое соединение устойчиво в отсутствии света и кислот.

Масс-спектрографический анализ показал, что соединение имеет тот же молекулярный нес и ту же эмпирическую формулу, что и лизолипин (I) и таким образом является изомером лизолипина (I). Для лизолипина (X) определена следующая структурная формула

В тонкослойной хроматограмме на силикагеле н системе хлороформаметанола (39:1) Rf =- 0,22 (Pf лизо.липина (I) = 0,39).

Лизолипин и его произнодные, кроме антибактериального действия, обладает также незначительным действием по отношению к дрожжелодобным грибам, например Сапс11с)а

aEbicoms, Candida CipoEytica u

Saccharamyces cerevisiae Он действует как против растущих и покоящихся микробных клеток, так и протин их сферопластов. Его действие основывается на торможении сйнтеэа клеточной стенки, Действие отчасти устранлетсл избытком липидов, например сфинголипидов, фосфоглицеридов, липидон клеточных стенок бактерий °

Лизолипин и его производные можно применять как таковые или вместе с другими тормозящими синтез клеточной стенки антибиотиками, например пенициллинами, пефалоспоринами, циклосерином, для борьбы с инфекциями, вызванными бактериями вышеуказанного рода, а также в качестве дезинфицирующих средств. Наблюдается синергитическое действие с некоторыми

6970 }6 антибиотиками, например пе .Нциллинами.

ДЛЯ ПОЛт>ЧЕ}ЗИ тт фа«тМаЦ<ЗВ (Нтт»<)KI<, препаратов антибиотик можно перемешиВатЬ С ПОДХОДЯ?ЩИМ ДЛЯ тОПИЧЕСYOI à, энтеральяого или парентерального применения неорганическим или Органическим наполнителем. Применя?)т такие вещества. которые не реагиру}от с новым соединением, например желатину, молочный сахар, краэгк<ал, стев.,стit:: т;" магния растительные масла, бензиловы".-. спиртыi или другие наполнятели ле карствь <}эарматтевтические препапаты могут, например, иметь вид таблеток, драже, порошка, суппозиториев, или например, растворов,. суспензий, эмульсий, кремов или мазей-., В соответствующем случае они стел:- :лязo;. e-.

НЫ Н /ИЛИ .»Одс»тт?т«ат BC Ito.!r<»«:I-..-«ПЬ НЫ вещества, например }<онсерва:-.ть., ст.--. бИЛИЗаТОрЫ, СмаяяяаТЕЛИ ИЛИ B:.ту)?ЬГа,ТОРЫ,. ОНИ МОГУТ таКЖЕ СОЛЕ.".);.

ДРттгne теРапев с иче<п<и Ценит}э B<»}4ec j."Ba. Дезинфицирующие вещества можно та}<же известным образ<эм т?1еремеши вать с подходящими наполнителями . .т .::3

Изобретение поясняется нижеследующими примерами.

Д р и pт e p 1 Яиоампулту с т л суспензии спор S. тг3.огасеапт нег »ii

96 суспендяруют B 5 мл 0,2 ":4 Qñcфат- 3<сс ного буфера с рН 7. 8 три колбы

Зрлеямейера с одной отбойной и :-.ргзгородкой, содержащие по 100 мл и.:— татЕЛЬНОГО раСТВОра, КОтОрЫй.В СттОЮ т очередь, на 1 л водопроводной во,-гы-, 3 содержит 4 г дрожэ}<евого экстра:::.-:ат

10 г солодового экстракта и

Г}ЛЮКОЗЫ И Рс»1 !

СУСПЕНЗИ? Я i <»т) с О?т?УСРЗ И ИЯК»«* iт !-„!» "

В Т ОттенI«<» Сут{ ЭК тт е ВращаРсщсй< г- т С?«б рационной машине (скорость Bpа =,:=-ня я

250 об/ьтик) пРН 27 С. 1< 25 см :: -палУче н ной т як вы o()p

6 т<ог}бак 9рлеямейера емкостью 2 л с 4 Отбойными перегородк ами т тр<т = ивасот 00 мл выаеуказаяяого пятат ель-1Солбы за.} е}„т - «ои 2 "тт С ипкуби p --,от на вращающейся внбт<»а-".= :-. ной массне < скорость вращея-"ÿ

120 Об/МИ}}?с В ;-ЕЧЕНИЕ 48 ЧаС.

О, 75 л куль турсы пер ен Ос H: —;=; ",:ермеятер емкостью 50 л, содерэхащий

30 л вы}}еуказанного питательного раствора, и инкубируют в теч::ие 5.-"= сутor< npò, 2 7о <» (тотем 15 л -:-ультуры переносят в ферментер 300 л в",-. ;::,-.=.— указанного питательного растэзора уг ЛОЗИН ВЫра}ттИВансяя g фЕт;:.тЕНТЕОЕ:. давле»т<тте О „5 ати c"i <)т»о(сть }псреттe!ã}ир}ания 450 c!!»/Ми т темгт -:= » Z7- / С расход воздух» 1 л/мин:, Опт?}мальяое

Образова?т?те антибиотика лпзолнпияа проиг колит гзоимерно после инкуба . ции в -:. е ение т ОО час. Культураль ый 6т.Д:.: .П .?с: i:П . - :

} "---: ой I С-"о IIОстаток „, т ель но е

i мг содержа*-! 1 яие ливо-„в и ь} т, а j

Фраскцп » ниже 0,05

0„46

0,58,с С» с

",;I,, О о т й

518

0,29 ниже 0,1

»)рак i,?tя -",: " 4 ст и = ацетона эфира .=.:-.;т 4. .6 ..<г -.: е:..:и:.-желты?к кристаллов ,нпина (;,?, т.пл, 260-262 С (с

Псз .,татстт-.—;-=тэ< растэоров крясталли-:,-:.т-.",:..-; И Из С()С Дня „.фРа}<Ц(ий ПРИ ПОВторной .-.-<ромзтографя}я на Сефадекс

:,П -- 20;::о;;:!Ос II(?,ïó÷!ròü еще 360 мг

});- :cI rjGP и;.< от с)тат 7, Г) ., 3H в Опыте тттпс»Г <тэт}т.т B .": Пт) BBCilтс. us SubtiEiS

- -,г —, .,„с нот, г.тттт ггс}тат« qg.т<т< гт B 1 d р .. с) р 2, 600 л полученноо :p?:. !.,»-.I.;-. 1 кулътуральяого раст,:,О -, ф-ГЭ»- гт с»т»,:т* Irr)II}таэт-Енс<тЕМ 2ф сэиль.-:.р от аль}}<)го вспомогательного ве}::тт .-.;:-:: It,гт:<а .: —.:м<эяой 3 е} 1слт< . 560 л ,. -;- туралья::.:";;-рпльтрата доводят

io рй 9 пря (}с}мощи раствОра едкого

;-".«òoe н ятз непрерывном экстракторе

«. с<стс«пат H:, I! Т дВ - тждЫ ХЛОрофОрМОМ B ,-.;-);;н ше,тия 2 „, ттеат<тявный водный . ."Н?тат вт.«бьтасыва?от 600 л хлорофо1)т:.Ясэйт фазттс }<анцентРИРУют в ваКУУ",1оэсуяаЮ»," 2 с0 1 C уКОГО ОСТДТКД о

:;ГО тдитГЕрнрттшат 2 Л ПЕТРОЛЕйяОГО ЭФИ"

Пс. с. т ° =и:. 1?< стЕТ?ЭС«лса?тяо ЭфИРНЫй

З:: С";10

8 и лччея гс«ъ тсс})ятме })т; 2 СтЛ„ОГ<» ПродуКта ..т-)сматогра:итру}от на колонке Сефа«,тт — 20 (ел;„т:,лиров =-нный стттитьтй ::= K clap u ý ), „ -r .< Á ä 7 3 см ...цЯ амет р ,.,!-,Оп < эф сзттуку» ме аяолом = 1; 1 со:..-;Орастью 20 мтч/час.- Улав т)а; -< ;=,",: -с т,-т ДТНОСИ оЕЛЬИОЕ Содрр " " :ЯНИН а ПЛБСОВЬЖ «1РссКЦИЙ ОП трет<еля?гэт;; —, -::;;.етрически при 360 нм. гос-,ределенное «О фракцияк 40-47 содер-. т.а?..ЯЕ ЛНЗОЛН сина (Х? ПРОсКЭВОЛЬНО

?.та о ра! Г1 1 «23стт гатсо1 ст1ед юще< 697056

12 нии пятна и повторной тонкаслайнай хроматографии Оказывается, чта лизалипин (Х) переходит н лизалипин (I) .

Пробу лизалипина (Х) хрома-.ографируют на Сефадексе LH-20 с метанолам.

Светло-желтая вначале зона при дальнейшей хроматографии становится все интенсивнее желтой. Желтые фракции злюата па тонкаслойной хроматографии идентичны с лизолипинам (Т).

Почти бесцветный вначале препарат лизолипина (Х) хранят в течение некоторых месяцев в холодильнике. За это время он приобретает интенсин Ioжелтый цвет. При помоци распределения Крейга из препарата получают еше незначительные количества лизалипина (Х). Главная часть представляет собой лизолипин (I) .

Предлагаемый способ Обеспечивает

20 получение BH THOHoTH råoêoãа комплекса абладаюцега антибак гериальным действием, а также может быть применен с другими антибиотиками B качестве дезинфицирующих средств. е10, 0 Е! Ц, - 3

0. А., Й

Пример 4. 300 мг лиэолипина (Х) с 10 мл пиридина и 10 мл ангидрида уксусной кислоты выдерживают в течение 2 недель при комнатной температуре, потом раствор выпаривают в вакууме. Остаток хроматограируют на 30 r силикагеля с хлароормам-уксусным эфиром (4:1). Первые 150 мл элюата содержат 48 мг неоднородного материала. Следующие

210 мл дают 220 мг светло-желтого маслянистого материала, который в тонкослойной храматограмме (силикагель, уксусный эфир в качестве

Элюента, закрашивание йадньж паром) показывает основное пятно с Rf

0,33 и два слабых загрязнений, Путем медленной кристаллизации из ав-,етона-воды образуются светло-желтые кристаллические призмы с точкой плавления 216-224 С. HMP — спектр в

С1 (100 11гц) . Проба содержит еще незначительное количество зтилацетата (из хроматографии). что можно заметить в ЛМР— спектре.

Если ацетилирование проводят, как обычно, только в течение ночи, то получают смесь двух продуктов моно- и диацетат, которые нельзя разделить кристаллизацией. В массовом спектре этой смеси сигналы при 683 и 681 мас.ед. (bl диацетата) праянляются со значительна уменьшенной интенсивностью.

П р и и е р 5. 1,5 г IIOJIy«еННоГо пo -п р.имеру 2 сырого продукта под"

}вергают распределению Крейга через

190 стадий в системе тетрахлорметан (3,42 л) — хлороформ (2,28 л) метанол (4 л) — вада (1 л). Сильно окрашенные з желтый цвет фракции.

26-54 содержат прежде всегo лизолипин (I) ° Ега выделяют, разбавляя фракции двойным объемам нады, выделяя органическую фазу„ взбалтывая водную фазу три>}Еды метиленхлоридом, соединяя органические фазы, высушивая сульфатам натрия и выпаривая в вакууме. Получают 258 мг Однородного по танкаслайнай храматаграмме лизолипина (I), который хроматографией на Сефадексе ЬН-20 и перекристаллизацией подвергают дальнейшей очистке. ,Фракции 76-100 при айалогичнай переработке дают почти бесцнетный аморфный порошок,(393 мг) — лизалипин (Х)," который нельзя очищать кристаллизацией. При тонкослайнай хроматографии на силикагеле н хлороформе-метаноле (39:1) Rf = 0,22. На тонкослойнай плитке гочти.невидимое пятна лизолипина (Х) при стоянии нн. воздухе быстрее при нагревании, становится темно-желтым. При элюираваЦИИИ ИИ Заказ 66 12 /60

Филиал ППП Патент, г

Формула изобретения

Способ получения антибиотическага комплекса лизолипина, включающего

30 лизолипин (I) формулы

0И (}- К -0 !

С113 и лизолипин (Х) -- изомер лизолипина (I) формулы

CHО т JI и r а ю щ и и с H теM, }тo штамм Я(:гер1.ощусез ч1ае,асеапivег

Tii 96 (НЕРП 8097) вырашиьают в à рОб .ных условиях в течение "-7 дней на

Питательной среде, с одержан}ей H=та -1и; —. ки углерода, азота и минеральные

60 сОли р с пОследующим Отделе 1}ив- .м i o 1а плекса, и при необходимости комплекс разделяют на састанные кампо}}енть} и переводят их н производны

Тираж 526 ПОППИ си ае

Ужгород, ул. Проектная, 4