700060 - Способ получения пептидов или их солей

Способ получения пептидов или их солей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

{11) 7ООО6О,ФИ ивов реМйия (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено OR0776 (21) 2379653/23-Q4 (23) ПРиоРитет - (32) 11. 07. 75 (3l ) 7507974-9 (33) Швеция

Опубликовано 25,1179.Бюллетень,% 43

Дата опублинования описания 25.11.79 (53) N. Кл.

С 07 С 103/52

A 6l К 37/02

Государственный комитет

СССР но делам изобретений н открытий (53) УДК 547.964.4 °.07(088.8) Иностранцы

Бу Турессон аф Экенстам, Лейф Эрик Аурелл, Карл Иеран

Клаэсон, Биргитта Гунилла Карлссон, Стиг Ингемар Густавссон и Гун Анита Олаусон (Швеция) Иностранная фирма АКТИЕБОЛАГЕТ КАВИ (Швеция) P3) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ

СОЛЕЙ

Изобретение относится к способу получения пептидов - новых биологи чески активных соединений, которые могут найти применение в биохимии и медицине, В химии пептидов широко используют метод постепенного наращиваь.. :< пе- тндной цепи путем конденсации активированных аминокислот, например, способом активированных эфиров (1).

Цель изобретения вЂ” синтез новых пептидов, содержащих хромогенную группу и обладающих биологической активностью.

Это достигается согласно описываемому способу получения пептидов общей формулы l.

D-Аз A2 A -NHRq где A„- аланил-, валил-, лейцил", пропил-, пипеколйновая кислота;

A - аланил- валил- глицил-, 2.

1 У лейцил-, изолейцил-, фенилаланил-, азетидинкарбо" новая кислота;

h -- аргинил, лиэил;

В вЂ” нитрофенил, или их солей, заключающемуся в том,,что соеди- нения общей формулы

Н Ы вЂ” R, где В имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетания остальных аминокислот, причем R используют в качестве защитной группы для С-концевого карбоксила первой аминокислоты.

Реакцию сочетания двух аминокислот или депиптида и аминокислоты

® проводят после активирования с(.-карбоксильной группы. Активированное производное может представлять собой, например, паранитрофенил, трихлорфенил, пентахлорфенил, N-оксисукцинимид или N-оксибензотриазоловый эфир, симметричный или асимметричный ангидрид или азид кислоты.

Синтез пептида состоит в ступенчатом добавлении аминокислот к

С-концевой аргинильной или лизильной группе, снабженной хромофорной группой, действующей затем как группа, защищающая карбоксил.

200060

Для защиты с6-аминогрупп применяют карбобензокси или трет,-бутилаксикарбонил или такие родственные им группы, как, например, параметокси, паранитро- или параметоксифенилаэокарбобенэакси.

Для защиты д -гуанидиновой функции аргинильной группы используют протониэацию группы НО или пара" толуалсульфонил; Я -амйногруппы в лизине защищают карбобенэокси-, трет,-бутилоксикарбонил- или паратолуолсульфонильной группой; с(;карбоксигруппу защищают метиловый, этиловый или бензиловый эфир.

В описании использованы следующие сокращения:

Аминокислоты (в левовращающей форме„ кроме особо отмеченных слу-. чаев): Арг вЂ” аргинин; Аэо вЂ” 2-аэетидинкарбоновая кислота; Ала " ала" нин; Гли вЂ” глицин; Иле вЂ” иэолейцин;

Лей вЂ” л«ейцин; Лиз - лизин; Фе вЂ” феНилаланин; Пип вЂ” пипеколиновая кислота," Про вЂ” пролин; Вал вЂ” валин;

АцОН - уксусная кислота; Бэ - бенЗоил; КБо - карбобвнзокси; ДЦКИ дициклогексилкарбодиимид; ДИФвЂ” диметилформамид; ТЭА вЂ” триэтиламин;

ЭА " зтилацетат; ГФХ - хроматография с фильтрованием через гель;

QBT â€” N- oêñèáåíçoòðèàçoë; Осу

-М-оксисукцинимид; MeOH - метанол;

ПНФ "- паранитрафеноксиу DHA вЂ” паранитроанилид; ТБК - трет.-бутилоксикарбанил; ТФУК - трифторуксусная кислота; ТСХ вЂ” хроматография в "îíêîì слое

Типы реакций, применяемых для ските=! а, Для синтеза пептидов (см. таблицу» ХХ «« - ХИП) разные стадии про. водят одинаковым способом, поэтому дано абщ..:; вЂ”.. описание реакцйй разных типов и «i таблице указаны промежуточные и вЂ :анечные продукты, методы, примене . :.,:е для реакций разных типов, и н-. которые физические данные.

Ре,:;«.,ц;-:я типа 1. Сочетание хромофорной г. .,ч«пы (. ) .

20 ммалей Ы N-з ащищеннаго аргинина или N"-, Ыщ-эащищеннога орнитина или лизина или соответствующим образам замещеннаго производного пвпти;:;а измельчают, тщательно высушиваю".. и растворяют в 50 мл свежеперегнанной Б,N,N,N,,N",N"-гексаметилфасфорной кислоты при комнатной твмпер:.«туре. Затем при перемешивании в отсутствии влаги добавляют

20 ммолей триэтиламина и 30 ммолей амина, соцержащего хромофорную группу в виде его изоцианатнога проиэвоцного. Смесь выдерживают сутки, реакционный раствор вливают в 0,5 л

2Ъ-ного раствора бикарбоната натрия при первмвшивании, Образовавшийся осадок отфильтровывают и тщательна

55 промывают раствором бикарбоната, водой, 0,5 н. соляной кислотой и снова водой. Из осадка продукт извлекают метанолом, Метанольный экстракт упаривают, остаток перекристаллизовывают или чистят с помощью хроматографии в тонком слое.

Реакция типа 2. Отщепление карбобензокси защитной группы (КБО) .

10 ммолей тщательно высушенного производного карбобензокси (КВО) суспендируют в 25 мл уксусной кислоты и при комнатной температуре в отсутствии влаги добавляют 15 мл

5,6 н.раствора НВг в уксусной кислоте. Через 45-60 мин реакционный раствор по каплям и при энергичном перемешивании вливают в 800 мл безводного эфира. Выпавший осадок атцеляют и промывают 2-3 раза эфиром порциями по 100 мл. Полученный бромгидрат N -деблокированного соедин, нения сушат над таблеткам гидроокио си натрия в вакууме при 40 С в течение 3-16 ч.

Реакция типа 3. Отщегление трет.вЂ”

-бутилоксикарбонильной защитной группы (ТБК) .

10 ммолей тщательно высушенного

THK вЂ” производного растворяют в

200 мл 25Ъ-ного раствора трифторуксусной кислоты в СН CR в отсутствии влаги при комнатной температуре. Спустя 20 мин раствор по каплям вливают в 500 мл безводного эфи-ра. Выпавший осадок отфильтравывак>т и тщательно промывают эфирам. Полученный трифторацетат N"--деблокированного соединения сушат над таб-летками гидроакиси натрия -" вакууме при 30 С 2"3 ч °

Реакция типа 4.Деблокирование вЂ”

-аминогруппы.

При ацилировании производного„получвннагo при реакции т«па 2 или должна.,присутствовать свободная с .-аминогруппа, Деблокирование этой группы осуществляют разными путями, например добавляют один эквивалент. бвзвоцнога третичного амина (триэтиламина или N-этилморфолина) к раствору производного HBr- или трифторуксусной кислоты в диметилформамиде, охлажденному до =10 С, При применении триэтиламина и НВгпроизводных,выпавший в осадок триэтиламин,гидробромиц удаляют фильтрованием. о

Производные с FBr - илн трифторуксусной кислотой можно также растворить в растворе бикарбоната натрия, иэ которого выделяемое производное экстрагируют, например этилацетатом, а затем органическую фазу су-. шйт и упаривают.

700060

Реакция сочетания:

A. С производным N-защищенного эфира °

К раствору 10 ммолвй производного пвптида или аминокислоты, выделенного в 20-50 мл свежеперегнан" ного диметилформамида, добавляют

11 ммолей N -защищенного паранитрофенил- или N-оксисукцинимидоэфирпроизводного аминокислоты при -10 С, о

Смесь выдерживают 1 ч при -10 С, затем добавляют к ней в качестве буфера 5 ммолей третичного амина.

Охлаждение убирают, температура реакционной массы самопроизвольно повышается до комнатной. 3а ходом реакции наблюдают с помощью TCX.

В случав необходимости реакционную массу охлаждают вновь и добавляют 5 ммолей основания. По окончании реакции раствор упаривают при пониженном давлении, полученный маслообразный остаток смешивают с двумя порциями воды и чистят перекристаллизацией или гельфильтрацией. При хроматографии фильтрованием через гель, примененной для очистки продукта, объем элюента полностью или частично совпадает с объемом производного активного эфира сочетаемой аминокислоты. Ilo окончании реакции (перед выпариванием) неизрасходованное производное активного эфира заменяют в течение 30 мин при комнатной температуре избытком (3-5 ммолей) первичного амина, например бутиламина.

Б. С N -защищенной аминокислотой или пептидом. Образование активного эфира по ходу реакции.

К раствору 10 ммолей указанного производного пептида или аминокислоты в 20-50 мл свежеперегнанного димвтилформамида, 11 ммолейй -защи<1, щенной аминокислоты или соответст>>ую>1им образом защищенного производного пептида со свободной С-концевой карбоксильной группой добавляют 11 ммолей К-оксибензотриазола или и -оксисукцинимида при -10 С.

В течение 1-3 ч температуру реакционного раствора (-10 C) повью шают до комнатной. За ходом реакции следят с помоцью хроматографии в тонком слое. По окончании реакции раствор вливают при перемешивании в 100-300 мл 5%-ного водного раствора. бикарбоната натрия.

Полученный осадок отфильтровывают и промывают водой. Затем чистят методом гель-фильтрации или перекристаллизацией.

Реакция типа 5. Отщепление всех защитных групп, очистка и ионный обмен.

0,2 - 1,0 ммоль защищенного производного пептида с хромофорной группой деблокируют обработкой 5-20 мл безводного HF- в присутствии 0,21,0 мл анизола в аппарате Сакакибара,, в течение 60 мин при 0 С. После окончания реакции и отгонки всего

HF- сырой продукт растворяют в 33%ном водном растворе уксусной кислоты и раствор чистят с помощью гель-фильтрации. Продукт сушат лиофилизацией, затем подвергают ионному обмену в колонке, содержащей слабо основную ионообменную смолу.

Сефадекс (Я)С йЕ вЂ” 25 в виде хлорида выдерживают до набухания в смеси метанола и воды (95:5). Для растворения и элюирования используют эту же смесь. Чистый продукт сушат при температуре ниже 0 С и пониженном давлении. Полученный продукт растворяют в метаноле и раствор вносят в колонку подходящего размера (объем

0,5 вЂ” 7,5 л, длина 100 см), заполненную сефадексом (R) Н вЂ” 20, набухшем в метаноле. Для элюирования используют этот же растворитель.

Элюат разделяют на фракции подходя30 щих объемов и непрерывно определяют их УФ-абсорбцию (254 нм.). Фракции, содержащие продукт, проверяют на чистоту методом ТСХ, чистые фракции объединяют и упаривают.

Производные пептида, полученные после удаления защитных групп с помощью НГ (аналогично реакции типа 5), в виде 30%-ного раствора в водной уксусной кислоте вносят в колонку (объем 0,5 вЂ” 2,0 л, длина 30см), заполненную сефадексом (R) G -15, набухшим предварительно в водной уксусной кислоте, продукт элюируют тем же растворителем. Фракции, содержащие продукт (контроль УФабсорбция при 254 нм), объединяют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе при 25С С, затем сушат при температуре ниже 0 С.

Хроматография в тонком слое.

Стеклянные пластинки покрывают тонким слоем кизельгеля F (Мерк).

Для проявлечия используют следующие системы растворителей (объемное соотношение): А вЂ” бутанол-уксусная

55 кислота - вода (3:2:1); Р вЂ” хлороформ вЂ” метанол (9:1)) Р )р- хлороформ-метанол (19:1).

По окончании хроматографии пластинку исследуют в УФ-свете (254 нм) и обрызгивают реактивом вЂ” хлорортотолуидином.

700060

1 I

I 1

1 I

СО м с

ГЧ с

С) СО

M с

C) Ю м с

CO м с

С) С) Ф с

С) (Ч

1 с

С) Ю

C) »Ф

»й с

С) »

LO с

»Ч

t-"I

»3»

ГЧ

Ю с м

M !

»ll

СО

I р

Г» с

»О

СЧ

+ g

Я с3

Гс с сМ мм

+ I

Я (с)

1Р (Ч !

Г с Р

I л

Г л

+ л

Г 4 !

1 о а а

" »») Х

Х m»d

1 1

Х Ф

) Е

»d (» о х

x M а»d

»») 1 1

Э (-К" и раох

0 g.X к с

»)» Г-» !

» к е

qj :) с

Г 4 е 1

И о

Х tC) tO

Е-» Е-» е х е

I Х

A х о !

Д в х

1 X г4»») хм хи о

1 о а

»»l g

OX о

Х К Д

Х д) 0)

Д 9 с

Е» 1 ш х

1 о о

° В "1

1 о . а с» д, о

I I

4»)) ц А А

Ь о4 о

ttI tO R tO

A A t Х

O O

Р3

0) о 4

l4 t4

Е»!

» ф х ха о х о,о х ж

Q) Г» а

»х»»

I О с х

\Г

4 х

И ! о

)с

Г» а

»»g

I о а

I о

» а

О а

А<

1 Х ох

ttI A

1 х»4 х о

1 Х а м х

В о о< х ш tt!

Х ЫР

»d Ю »Г У с с м м

» Х х х х

Pc I о

m Ц

6 с

4 Ь

Х Х

Ж Ш -»

VOuu!.u

ОЪ

М л

» »> л л

% (М л» -»

СЧ

° » аА (>

Г ) л»

01 а, Ч

» аА

СЧ

° »

» >

С>

»п

»!Э

Ю м

»>1

С1»

П>

»,1:» >»

С> (3 3»

» ас>

Ю EC>

» г

СЧ Г сС>, м

»Л»О ! !

»>> л»

0:>

С> аА

Р . ни в м Цн

Х о>

Х Х е е

Г-» Г-» »»3 CP

»4 д» Р ь (Ч в х

1 В х

Д о ш о

Х Ш

% в х

И о

М в х х

I ж

Гл

1 о

»»4 A

Ц о

И х

»D л х

Ю (>

CO м

Ю.«э х х м, х х

lg»

>; < х х

1 1

1» L

» » а а

1 1

Ф C

»>>

И м ш х, х-, 1 Fl х ф»

Ь»4

Г»

» а

1 о а

»0

1 ь>

1:, (>

I Г4 х,»>, х

I>, I

Д U

C»l л! .

1 л ч

Ц о

CD С и

»»»

-h х в х

С»3

i»C>

«л

»» х

1 о

И и

1 о а

Д и

1-1

Э х

A и х

»>>

«А нко

oxg

K н

» х

1 о я !.»

4; а

4 в х

Я х

»>, (х

М !

»»4

Q а!

1 а

»>, 1

4 C

А Д

I о<

SQ Д щ. -Х

Х ес| о

»4 а ю

»!»»4 ах

Д Я

/ ! о н L

Х gI

1 с» о и

» а

О х

° И

I в х

А о

С0

М! х

» а

3 ех

Ц И

1 о

700060

О\

СЧ л с4 с

ГЧ

I м л с. о м л

1О с л л

Ch о л!

1О с лч

1 щ сй ц1 с с о о ь :Й о (Ч м с о О м с о

«Ф с! с

Ю! с

i«! с

Ю Ф о

"Ф Й с о с

I I

+, с м с

«Ф

1О

I ю

Ю (Ч Ф

1 д, Ю с м

I м м л !

Cl с л!

in !

Ю с л

I н к ц. х . х е е

Гл Гч к х

ГЕ х е е

Гл Г-

)( е .Гч а м ю г о гч ю

ОЭ. Г Г л л ю ю а1

О 9 9

° у «ф ер с с с (Ч (4 4

ilj Ф с м

К !

« о

Й е м

9 е.

1 о.

Ф4 в ж

I о

f1I е х

9 х х х с

4 с ° ( х х х б

Я с

Х (1

I с(х

1 Гч

f4 а

4 Я

Ф ((и

9 Ж 9

1- ъ(с! Ц фд

1 и

А4 Рж

1 Га 1 ч

1 П

Х 9 в

I°. а о< аж

1 1 е

Г х

)( э( х

4 ж

С4 о

L о

I о

1:»

Г с х л э( х е ф« р« ! (6

Р4

Ь ! о

Г1 у L («

>(« э(3

1 ф с(9 Ol

K c3

1 о

1а

9 е

g н!

Га!

О 3 с м. !!1 Ln ц 5 о

1 м х

3 м о и

1: о

1 м

Ю с» х э( х и ю

И! Г а 4 а

m 6 е

I а

Гаянэ пм ы,о! ГЧ СЧ ф

Ю и

° Ь

° Й

Р1 а, D

700060

1О

Ф о

Ю ж о

>Ъ о

Х Ъ

Ь., о х (б л

Е 0

Ф ч

Р о

Р3

0 а3

Ю "1 !

С3

3А

i Ф ;;. Фф М"

- ":« ." jap": " Ф: "

15 g.; yg .-. рффи) . изобретения отличающийся тем, Формула

Составитель B. Волкова

Техред Jl, Алферова Корректор Р ° Реиетник

Редактор Т. Загребельная

Заказ 72бО/б2

Тираж 513 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб °, д„4/5!

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4

Способ получения Цептидов общей формулы 1:

D w A вЂ” A вЂ” A вЂ” NHR д Ф где Aq " аланил-, валил-, лейдил-, пропил-, пипеколиновая

-. кислота; аланил-, валил-, глицил-, лейцил-, изолейцил-, фенилаланил-, аэетидинкар" боновая кислота!

A > - аргинил-, лиэил;

R - нитрофенил или их солей, что соединение общей формулы Б И-R, где R имеет указанные значения, подвергают взаимодействию с соответствующей аминокислотой и далее требуемую пептидную структуру постепенно наращивают путем сочетанйя остальных аминокислот, причем R используют в качестве защитной группы для С-концевого карбоксила ц первой аминокислоты, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Шредер Э., Любке К. Пептиды, ч. 1. - Москва: Мир, 1967, с. 11б.

Способ получения пептидов или их солей

Патент 700060