Способ количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в почве

Способ количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в почве

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАЙ ИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ (1 ! 70083 I

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.05.78 (21) 2613229/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.11.79. Бюллетень № 44 (45) Дата опубликования описания 30.11.79 (51) М. Кл.-" б 01N 31/08

Государственный комитет (53) УДК 547.963.3 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения

И. В. Асеева, Н. С. Паников и О. T. Чурсина (71) Заявитель Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государс-,венный университет им. М. В. Ломоносова (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ПОЧВЕ

Количество оснований ДНК, (ммоль/!00 r почвы) Относительная ошибка метода, %

Метод

6,0 0,6

30,0 1,3

Прототип

+10

Предлагаемый

Изобретение относится к способам определения нуклеиновых кислот в почве и может быть применено в почвоведении, микробиологии, биохимии.

Известен способ количественного опреде- 5 ления дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в почве путем экстракции щелочью (0,3 í. NaOH при 20 С), осаждения концентрированной соляной кислотой фракции гуминовых кислот, содержащей ДНК, с по- 10 следующим гидролизом 72% -ной хлорной кислотой и выделением пуриновых и пиримидиновых основании с помощью ионообменной и бумажной хроматографии с последующим определением пуриновых и пи- 15 римидиновых оснований по их поглощению в ультрафиолетовой части спектра.

Недостатком способа является длительность и его невысокая точность.

Цель изобретения — сокращение време- 20 ни анализа и повышение его точности.

Достигается это описываемым способом, который заключается в том, что дезоксирибонуклеиновую кислоту экстрагируют из навески почвы 0,65 — 0,75 н. гидроокисью 25 натрия при 60 — 70 С, осаждают соляной кислотой с последующим кислотным гидролизом 0,1 н. соляной кислотой при 37 — 40 С в течение 24 — 30 ч, выделением аденина и гуанина.бумажной хроматографией и опре- 30 делением по их количеству содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Отличительная особенность способа состоит в том, что щелочную экстракцию осуществляют 0,65 — 0,75 н. гидроокисью натрия при 60 — 70 С, кислотный гпдролпз ведут 0,1 н. соляной кислотой прп 37 — 40 С в течение 24 — 30 ч, выделяют аденпн и гуанпн бумажной хроматографией и по их количеству судят о содержании дезокеирибонуклеиповой кислоты.

Результаты приведены в таблице. Как видно из таблицы, количество ДН1, определяемое предлагаемым способом, равно, например в дерново-подзолистой почве

30,0 ммоль оснований/100 г почвы, что выше в 5 раз по сравнению с прототипом вследствие повышения точности и надежности метода. Относительная ошибка определения уменьшается вдвое при более высокой воспроизводимости результатов.

700831

Пример 1. Берут 2,5 г воздушно-сухой почвы, освобожденной от растительных корней и просеянной через сито с отверстиями

1 мм, и экстрагируют ее 20 мл 0,7 í. NaOH при 65 С в течение 25 ч. Щелочной экстракт (15 мл), охлажденный до 0 — 5 С, нейтрализуют концентрированной НС1 и подкисляют до рН 1,1. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают охлажденной

0,1 н. НС1 и оставляют на 24 ч при 37 С с 10

20 мл 0,1 н. НС1. Жидкость объемом 15 мл упаривают на водяной бане, сухой материал растворяют в нескольких каплях 0,1 н. НС1 и количественно переносят на хроматографическую бумагу в виде полосы. Разделе- 15 ние оснований проводят в системе растворителей метанол: концентрированная НС1:

: вода (70: 20: 10) в течение 25 — 27 ч (нисходящая хроматография) . Обнаруженные при просмотре в ультрафиолете пятна осно- 20 ваний элюируют 5 мл 0,1 н. НС1 (37 С, 12 ч) и спектрофотометрируют против элюента в прямоугольных кварцевых кюветах (ширина 1 см) при следующих длинах волн: аденин- при 228, 260 и 290 нм, гу- 25 анин- при 224, 250 и 290 нм, Расчет количества оснований производят по следующим формулам

А= " " " 0399

1,82

1- 2 2оо — (Ры4+ +»o) Q 714

2,00 где А и à — количества аденина и гуанина в ммоль/5 мл элюата соответственно; 35

D — величина оптической плотности при длине волны Х; 0,399 и 0,714 — коэффициенты для пересчета величин оптической плотности в размерности концентрации;

1,82 и 2,00 — константы, характеризующие 40 спектр поглощения аденина и гуанина соответственно.

Содержание ДНК в почве рассчитывают по формуле

С (A + ) n2100

) а

Формула изобретения

Способ количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в почве путем экстракции ее нз навсски почвы щелочью, осаждения соляной кислотой с последующим кислотным гидролизом и выделением образовавшихся азотистых оснований бумажной хроматографией, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью сокращения времени анализа и повышения точности способа, щелочную экстракцию осуществляют

0,65 — 0,75 н. гидроокисью натрия при 60—

70 С, кислотный гидролиз ведут 0,1 н. соляной кислотой прн 37 — 40 С в течение

24 — 30 ч, выделяют аденин и гуанин путем хроматографии на бумаге и по их количеству судят о содержании дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Составитель С. Хованская

Тсхред А. Камыш никова

Корректоры: Е. Осипова и Л. Орлова

Редактор А. Соловьева

Заказ 2519/17 Изд. М 626 Тираж 1090 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раугпская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 где С вЂ” содержание ДНК в почве в ммоль оснований/100 r почвы; и — разведения, произведенные в ходе анализа; а — навеска почвы, г;

А и à — количества аденина и гуанина в ммоль/5 мл элюата.

В итоге получают содержание ДНК в дерново-подзолистой почве, равное

30,0 ммоль оснований/100 г почвы.

Пример 2. Берут 2,5 г почвы и экстрагируют ее 20 мл 0,65 н ХаОН при 60 С в течение 25 ч. Остальные операции и расчеты производят по примеру 1. Получают выход ДНК для дерново-подзолистой почвы, равный 29,6 ммоль оснований/100 r почвы.

Пример 3. Экстракцию ДНК из почвы с последующим ее осаждением кислотой проводят по примеру 1, затем осадок гуминовых кислот, содержащий ДНК, дваукды промывают охлажденной 0,1 н. НС1 и оставляют на 30 ч при 40 С с 20 мл 0,1 н. НС1.

Далее анализ осуществляют по примеру 1 и получают содержание ДНК в дерновоподзолистой почве, равное 30,9 ммоль оснований/100 г почвы.

Использование предлагаемого способа имеет следующие преимущества по сравнению с известными: ускорение процесса и повышение его точности.