Способ получения биомассы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Уз 1г пате.из ио-; „; „.,„

0.."ï":èîòåëà ivi г-.

П ИСАЙКЕ

< 7Î1545

Союз Советских

Социвпистичесиии

Республик (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 28.09,76 (21} 2406805/28-13

i 23) Г1риорнтет — (32) 30.09.75 (51) М. Кл.

С 12 D 13/06

Гоаударстовнный комитет

ССОР ао илам изоорвтвний и отирьпий (31) 618191 (33) США

Опубликовано 30.11.79. Бюллетень № 44 (53) УДК 668 37? (088.8}

Дата опубликования описания 05.12.79 (72) Автор изобретения

Иностранец

Дональд Оливер Хитцмэн (США) Иностранная фирма

"Филипс Петролеум Компани * (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ

Изобретение относится к технике получения белка из одноклеточных микроорганизмов путем выращивания последних на углеродсодержащих субстратах.

Известен способ получения биомассы, предусматривающий выращивание микроорганизмов в условиях. аэрации на питательной среде, содержащей окислеиные углеводороды в качестве источника углерода, источник азота и необходимые минеральные соли (1).

Подобное сырье легкодоступно, его получают из нефтяных источников природного газа, различных процессов обработки сточных вод и отходов и превращений метана, и фермеитации разного рода злаковых, сухой перегонки древесины н т. и.

Окисленные углеводороды являются сравнительно дешевым сырьем для ферментативных процессов, причем это сырье частично окислено, так чта в процессе выращивания и конверсии сокращается потребность в молекулярном кислороде.

Однако при промышленном осуществлении процесса получения биомассы из одноклеточных микроорганизмов его необходимо проводить при относительно умеренной температуре 2050 С, предпочтительно не выше 35 С. Микробиологическая конверсия является высоко зкзотермической реакцией. окисления с высоким выделением тепла, которое должно отводиться непрерывно и последователыю для исключения перегрева системы и гибели микроорганизмов. Кроме того, повышение температуры создает опасность ограничения роста микроор. ганизмов и воэможность снижения в результате этого эффективности процесса.

Целью изобретения является интенсификация процесса.

Это достигается тем, что в предлагаемом

15 способе получения биомассы выращивание осуществляют при 45 — 65 С, при этом в качестве микроорганизмов используют бактерии рода

Bacillus штаммы N МЯЯ В вЂ” 8065 или

NRRL  — 8066.

Qg Кроме того, в питательную среду вводят соль марганца, Способ осуществляют следующим образом.

Микроорганизмы в виде бактерий рода Bacillus штаммы ИЯЯ( — 8065 или ИЯЯ1 В-8066 .25 выращивают в условиях аэрации на питатель701545 ной среде, содержащей окисленные углеводороды в качестве источника углерода, источник азота и необходимые минеральные соли при

45 — 65 С, предпочтительно при 50 — 60 С.

Концентрацию субстрата в ферментере поддерживают на уровне 0,01 — 5 объем/об.% для исключения торможения роста бактерий.

Кислород подают в культуральную среду в любом виде, способном легко ассимилировать ся внесенными микроорганизмами. Можно ис- I o пользовать молекулярньй кислород, который содержится в воздухе, например, при атмосфер ном или повышенном давлении, или в воздухе обогащенном кислородом, или из другого доступного источника в зависимости от условий 15 проведения процесса.

Воздух с нормальным содержанием кислоро. да подают в количестве 0,1 — 10, предпочтительно 0,7 — 2,5 объем/мин на объем жидкости 6 ферменте или в пересчете на кислород, соответ- 2D ственно 0,02-2,1 и 0,14-0,55.

Давление в процессе микробиологической конверсии поддерживают от 0,1 до 100 ат, предпочтительно от 1 до 30 ат, а еще предпочтительнее немного выше атмосферного, учитывая растворимость кислорода.

Использование давления немного выше атмосферного способствует повышению концентрации кислорода, растворенного в водной культуральной среде, что в свою очередь способствует повышению скорости роста клеток.

В качестве окисленных углеводородов используют с ирты, кетоны, сложные и простые эфиры, кислоты и альдегиды, по существу водораст. воримые, но содержащие до 10 углеродных ато- 35 мов в молекуле.

Из окисленных углеводородов используют следующие соединения: метанол, этанол, пропанол,бутанол,пентанол,гексанол,гептандиол-1,7; гептанол-2; 2- метилпентанол-4; пептано40 l .

1 вая кислота; 2-метилбутановая кислота; пен- . танол-2; 2-метилбутанол-4,2-метилбутанол-3 ; бутанол-2; 2-метилпропанол-1,2-метилпропанол-2, протйнол-2; муравьиная, уксусная, пропановая кислоты; формальдегид; ацетальдегид; про 4> паналь; бутаналь; 2-метил-пропанапь, бутановая кислота; 2-метилпропионовая кислота; пентановая кислота; глутаровая кислота; гексановая кислота; 2-метилпентановая кислота; гептадионовая кислота; гептановая кислота; гептанон-4; гептанон-2; октановая кислота; 2-этил-гексановая кислота; глицерин; этиленгликоль, пропиленгликоль; метил-этиловый эфир; диметиловый эфир; ди-н.пропиловый эфир; пропанон-2; бутанон-2; диэтиловьй эфир; н.пропилизопропиловьй эфир, включая смеси двух или более из них, а также материал под названием "меиловое топливо", представляющий собой смесь метанола и регулируемого количества высших спиртов, содержащих до 4 атомов углерода в моле куле.

Источником азота может служить азотосодержащее соединение в виде, пригодном для метаболического использования микроорганизмами. Используют. также различные источники органического азота, например, белки, мочевину и т. п., но практически используют неорганические источники азота, например аммиак, едкий аммоний, различные соли аммония, в частности цитрат, фосфат, сульфат и пирофосфан аммония.

Удобен для использования газообразный аммиак путем барботирования через водную культуральную среду, рН культуральной=среды поддерживают от 5 до 9, предпочтительно от 6 до 8, при этом бактерии рода Bacillus штаммы NRRL  — 8065 или NRRL  — 8066 предпочитают для роста соответственно рН от 6,2 — 6,8 и от 6,2 до 65 причем в среде УМ2, Кроме источников углерода, азота, кислорода в культуральную среду вводят необходимые минеральные соли для обеспечения роста микроорганизмов и доведения до максимальной ас- симиляции окисленного углеводорода клетками в процессе микробиологической конверсии.

Из минеральных солей используют ионы фосфора, магния, кальция, натрия, марганца, молибцена и меди.

Состав среды (УМ2 — твердая), г: монокалийфосфат 2,0; дикалийфосфат 3,0; сернистый магний семиводный 0,4; хлористьй кальций двухаодньй 0,04; июристьй натрий 0,1; сульфат аммония 2,0; агар 15,0; дистиллированная во да 1000 мл.

Добавляют также раствор следовых минера. лов,г:сульфат меди 0,06; иодистый калий 0,08; гидрат сульфата марганца 0,3; молибдат натрия двухводньй (Naz Mo0 2Hz 0) 0,2;

/юрная кислота 0,02; сульфат цинка семиводньй 2,0; хлорное железо шестиводное 4,8; дистиллированная вода 1000 и серная кислота (конц) 3 мл. Перед употреблением вносят в среду стерильньй метанол до 1,5 об.%..

В случае жидкой среды агар не вносят. Другие материалы, например дрожжевой экстракт, витамины, биотин и г. п., или, другие факторы роста добавляют в количествах, известньи, в области ферментации.

Бактерии рода Bacillus штаммы ййй! 8—

8065 и ЯВЯМИ В вЂ” 806б хранят в коллекции

США под номерами 47 и 72 соответственно (департамент сельского хозяйства, служба: сельхозисследования. Исследовательская лаборатория Северных районов, Пеория, Иллинойс, 61604) .

01545 б>

Культура N 72 NRRL  — 806б грамполо>кительйая, спорообразуюший микроб формы толстой палочки, окрашенного пигмента не имеет.

Характеристика и свойства используемых бактерий в сравнении со свойствами известных культур рода Bacillus приведены в табл. 1.

В случае промышленного продуцирования больших количеств микробных клеток процесс выращивания проводят непрерывно, и все оборудование, включая реактор или ферментеры, контейнеры, трубопроводы, охлажда1ощие или циркуляционные приспособления, стерилизуют с помощью пара при 121 С, например, 1S мин.

Простерилизованный реактор <инокулируют культурой микроорганизма в присутствии всех необходимых питательных веществ.

С началом роста культуры непрерывно подают раздельно воздух, питательную среду, источник азота и окисленный углеводород. Скорость подачи потоков ингредиентов может колебать ся,цля поддержания возможно быстрого роста клеток при эффективном использовании подаваемого окисленного углеводорода и при обеспечении высокого выхода веса клеток на вес загруженного источника углерода, Скорость подачи источника углерода регулируют так,.что подаваемое в ферментер количество равно количеству, потребляемому микроорганизмами для исключения пересьпценности в частности токсическими материалами, напри мер спиртом или альдегидом,которые могут тормозить рост или приводят к гибели микроорганизмов.

Сырье стерилизуют до момента его подачи в ферментер.

В случае, если окисленный углеводород, например метанол, этанол или формальдегид, имеет способность стерилизовать прочие материалы, то целесообразно добавлять этот компонент в прочие потоки, например в минеральную среду„при этом последнюю в этом случае уже не подвергают отдельной стерилизации при помощи тепла и т. п.

Выращивание микроорганизмов ведут в ферментере известного типа, предпочтительно заполненном пеной, которая образуется при используемой температуре ферментации и обеспечивает высокую степень роста. В этом случае необходимо следить за скоростью роста во избежание выброса пены из ферментера, что может привести к уменьшению в нем объема жидкос20

40

l,0

l,5

50

7

Эти штаммы являются высокопродукп!вными при относительно высокой температуре ферм ентации.

Культура N" 47 NRRL.Â-8065 грамположительная, спорообразующий микроб формы толстой палочки, окрашенного пигмента не имеет. ти и потере.«одержимого. !!«11;< с 10 О(,.;ву«! акже высокому содержа!!»10 в «1!«1сл!с р:(сп<оренного кислорода н новьнпснному его»ср«»0су, необходимому для»0, 11!Ср>1;в . »» в<и«<. 1с01! плотности клеток и бьгсгрол!у ро«-<у .11!1«у<0 «а< низмов.

КаК клст Очнь!Й, т!!к н в11сл ".1с 10 1»ьl((ilj. <>;! <. } т извлекя!От нзвестиьглв! способа; 11.

Кч стк» В I f 1! э 3(1>. Нвсн! в (1>с в>,", J .10«» ГОсвОООждеш!ый OT Icilхн0 также обрaGoraть мстодом сольвентной экст1>вкц!!!! 1!(1!1»! эксг:-,вкц:<ч

ЩЕЛОЧЬЮ ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ДРУГ»Х l:-1!С1;ЛСТО; продуктов, например цитмснтов. в1!!Ч1л!1<1,< в»0.<

Орга1н!чсскl!х кислОт, 1!Оду:! :1! »: ч в и ГО!в-с(ñ выра»я»в энп я.

При м с р l. 1!ровсд<я< вснр< рь;в!!ь1<< il".с цесс фермснтацин, для чего беру! . >00,":,<1< 11!!Окулума водной <»<спер«ни c»0101(1. у»1:<урь1

И 72, NRl>,L,  — 80бб;! 1<ь(рв1!!(-в;j< i< 1 среде В11 — M с 1,> Об.% мста!<01!а. Сос-ав срс!!hI BI I — М, r/JI: MOHofca:I»Éôo0!1 !<«r 2,0; фосфат 3,0; сульфат л!(<»1»!я «с-,. .Н«111(ы(; 11,-1„ хлористый кальций двухводш (й <.1Я i: «у.!ь(1>,!т аммо1в!я 2,0 и 10 л(л/л р".,ств<.(в «т!с.,0»1.!.< . »нералов.

Раствор следовых минералов имеет с>!«1<у!(<ШИЙ СОСТавз Г/Л: СУЛЬФВТ >ХС;1Сэв ССЛП»10ЦНЬ!й<

0,11; сульфат цинка семиводн1,.й (1.03. «ульфат меди шгп1водный 0,02; «у..ь,;ч!! марев,!<1< (гидрат) 0,02 и 1 льв/л концс1<гр»рова>!1!О!1 серной кислоты.

Указанный инокулум вносят в ферл!снтср, имеющий перемеип!ва1ощсе и аэрнрунчцсс устройства, с 2 л среды (1!a во<1<>1!1! <>во!!но

Состав среды FM--12

Фосфорная кислота 8S ;". .. 1,1:1 \ 0

Хлористый калий. г

Сульфат магния сем1!вод»1

Хлоривтый кальций двухвадный, г 0,2

Хлористый натрий, г 0,1

Раствор следовых минералов, мл 10,0

Дистиллированная вода, л до 1

Состав раствора следовых минералов, г/л: сульфат меди пятт!водный 0,0(>; нодн«тый к;1лий 0,08; хлорное железо нес(вводное 4,80; сульфат марганца (гидрат1 0.30; л(о>в!бд.11 натрияя двухводный 0,20; сульфат !!1!1»са селиводный 2,00; борная кислота 0,02; ко«щс1! гр11рованная серная кислота 3 мл в .н!«т!!1!лпрованная вода до 1 л.

701545

Первоначальное содержание метанола

1,5 о6.%/объем рН вЂ” 6,7, температура 55 С, скорость перемешивания содеожимого 1000 об/мин, воздух подают со скоростью 2 л/мин.Непрерывно подают едкий аммоний для поддержания 5 рН в интервале 6,7 — 6,9, а также используя его в качестве источника азота.

Затем, после хорошего размножения инокутжма, подают непрерывно питательную среду с содержанием метанола 5% (объемы) и отводят соответствующий объем эфлюента из ферментера, Скорость подачи питательной среды 150— 800 мл/час в течение 800 ч со средней продолжительностью удержания клеток в фермен15 тере от 2,4 до 5 ч.

Из эфлюента через некоторое время отбирают пробы для извлечения клеток, которые сушат, взвецжвают и анализируют на белок.

Концентрация клеток составляет от 12 г/л (сух. вес) в начале опыта (24 ч) до 18 г/л че. рез 190 ч и до 24 г/л в конце опыта. Конвер-. сия метанола в извлекаемые клетки достигает

44% (от исходного загружаемого) .

Таким образом, бактерии рода Bacillus штамм

NRRL  — 8066 можно легко выращивать непрерывным способом при 55 С на метаноле в качестве источника углерода.

Клетки этого вида содержат высокое про30 центное содержание белков.

При мер 2. В другом типе ферментера непрерывного действия выращивают культуру

NRRL.В 8066 как описано в примере 1. Ферментер инокулируют 500 мл водной дисперсии

35 культуры, выращенйой в течение 26 ч на среде УМ2 с 1,5 об.% метанола (состав среды описан выше).

Инокулум вносят в ферментер, как описано в примере 1. Ферментер содержит 2 л среды

FM — 12, описанной в примере 1 за тем исключением, что в среду добавляют лишь 5 мл/л раствора следовых минералов.

Первоначальное содержание метанола

1,5 о5.%/объем рН вЂ” 7,1 и температура 53 С.

В течение первых двух часов перемешивания и объем подаваемого воздуха медленно повышают до 800 объем/мин и 2 л/мин соответственно, Для поддержания рН 7 — 7,2 и в качестве источника азота вводят едкий аммоний.

После установления хорошего роста инокулума в течение первых 24 ч подают непрерывно питательную среду, содержащую 7,5 об.% метанола и 0,05 г/л гидрата сульфата марганца и отводят соответствующие эфлюенты из ферментера.

Скорость подачи питательной среды составляет 200 — 400 мл/час в течение 94 ч. Средняя про. должительность удерживания в ферментере составляет 3 — 5 ч. Эфлюент из ферментера периодически проверяют взятием проб, извлекают клетки, сушат и взвешивают.

Концентрация клеток после 24 ч составляет

17 — 26 г/л (сух. вес).

Конверсия метанола в извлекаемые клетки составляет 43% от загруженного.

П р н м е р 3. Проводят непрерывную ферментацию, используя культуру Р 47 НЯЯ( — 8065.

В ферментер загружают 2 л среды FM — 12,. описанной в примере 2, но с использованием обессоленной воды, Затем загружают 500 мл водной дисперсии культуры N 47 ИЯЯ1 В-8065, выращенной в течение 11 ч на среде JM2 с

1,5 об.% метанола.

Первоначальное соде1>жание метанола

1,S об.%/объем рН вЂ” 6,45, температура 54 С. Едкий аммоний вносят, как в примерах 1 и 2, для поддержания рН 6,3 — 6,6 и в качестве источника азота. Перемешивание и подачу воздуха постепенно повышают до 400 об/мин и до

0,5 л/мин соответственно в течение 7 ч. После

11 ч непрерывно подают питательную среду

FM 12, приготовленную на водопроводной во- . де с 2,5 об.% метанола и добавлением солей по 1 г/л КН2Р04 и КзНР04 каждой и небольшого количества противопенного средства. Через 28 ч;подачу изменяют, добавляя гидрат сульфата марганца до увеличения его концентрации (в сырье) в два раза, для стимулирования потребления клетками кислорода.

В течение 101,5 ч опыта вносят дополнительные количества . следовых минераЛов. Как установлено, они не оказывают стимулирующего действия на рост клеток.

Кроме воздуха в ферментер после 24 ч работы подают кислород со скоростью от 0,12 до 0,4 л/мин, За это время соответственно повышают скорость перемешивания от 400 до

800 об/мин, Из эфлюента периодически отбирают пробы для извлечения клеток, которые сушат и взвешивают.

Скорость подачи среды повышают от

300 мл/час при 28 ч до 850 мл/час к 71 ч и

1070 мл/ч к 95 ч. Продолжительность пребывания клеток колеблется от 1,8 до 2,5 ч в течение последних 30 ч, Концентрация, клеток достигает 7 — 10 г/л (сухой вес), а конверсия ме. танола в извлекаемые клетки 50% от загруженного.

Таким образом, культура Х 47 МЯЯ В вЂ” 8065 дает достаточный выход микробных клеток при выращивании на метаноле в качестве единственного источника углерода при относительно высокой температуре ферментации.

701545

25

9

При ме р 4. Содержание белка в клетках новых видов Bacillus 70 — 85 вес.%, причем эта величина получена умножением весового процента азота (по Къельдалю) в сухих клетках на коэффициент 6,25. При гидролизе высушенных клеток и анализе на аминокислоты методом газовой хроматографии устанавливают, что содержание белков находится в пределах

55 — 70 вес.%.

Распределения аминокислот в образце бактериальных клеток с использованием культуры

Р 72 NRRL  — 8066 следующее.

Незаменимые аминокислоты, г/100 г сухих

15 клеток:лейцин 5,52; изолейцин 4,68; лизин 5,36; метионин 1;38;цистин 0,05; треонин 2,93; фенилаланин 2,72; тирозин 2,00; триптофан 0,79; валин 5,25, Заменимые аминокислоты, г/100 r сухих клеток. алании 5,83; аргинин 2,93; аспарагиновая

20 кислота 6,38; глицин 3,76; глутаминовая кислота 9,95; гистидин 1,18; пролин 2,37; серии 1,96; всего — 65,04.

Всего незаменимых аминокислот 30,68, причем содержание цистина и метионина сравнительно невелико.

- При этом некоторые образцы клеток имеют

0,00 r цистина на 100 r сухих клеток, что может быть отрегулировано добавлением соответствующих количеств синтетического цистина или метионина в рацион.

Пример 5. Проводят контрольный опыт, в котором несколько культур термофильных микроорганизмов из рода Bacillus испытывают на рост при 55 С в разнообразных средах, используя при этом Bacillus i subti lis ЛТСС 10774, Bacillus stearothermophilis АТСС 12987, Bacillus stearothermophil is ИВВ(В 1102; Bacillus

coagulaus МВВ(В 1103; Bacillus coagulans

ИВВ(В 1168 и Bacillus licheniformis

ИВВ1 В 1001

Результаты испытаний приведены в табл. 2.

В качестве питательного бульона (ПБ) служит культуральная жидкость; содержащая 3 г/л мясного экстрькта и 5 г/л пентона. Среда М2 описана ранее, но в случае жидкой среды не . вводят агар.

Результаты опытов показывают, что бактерии

NRRL  — 1102 не растут даже на питательном бульоне, АТСС 10744 не растет в присутствии метанола. Прочие культуры, размножаясь в присутствии метанола, не способны испольэовать последний в качестве единственного источника углерода и энергии для своего роста, Получаемая по йредлагаемому способу биомасса является ценным источником белков или протеинов для людей и животных, при, этом в случае потребления в качестве пищи людьми клетки можно обрабатывать различными веществами для снижения содержания нуклеиновых кислот, а при употреблении же их в качестве кормов для животных подобная обработка не обязательна.

701545

Ю 4

Ч, Рп а О И 00

I о а в у8

С) О С

1 1 а а ю

Р )

Щ а Ф

М) 1

Ю О Ch

1 I о ,,«м х

"О о

4 ) м

00 ° л

ЧР ц>

С 4

<." м О э

0! п и о

I (4

Х й( О

C) Си) I

СЧ

00 о! о ю

М

Ю

CIS («О о.С«Ъ

1 н х

Й

«О о"

С 4

I иф ч а х

1Г) Ол

С 4,О 00

С «! о а

y f II О

«О ии р О е ж

701545

Р3 и

@, +p C4

f5 цр, Ф М

+ + I I + I I I I

+ ! + l ! I

+ + I + I I I !

+ + I + I I I I! +ч- 4- I +++ +

+!+ 1- i !-++ +

В Р»

И + ОО О ж м О

;Я tel

Ж .

О

Я, Р,д »

m p4 5 5+ Pike Q4)3CI + CCI

Й о х

3. о р о

Д ц

;; й

Д д о

R o !=! х о

Ихаф

Р х Я, Я о

Йн о,,х Ч х о

С9 сФ Щ

b н о о ej о р, х g3 д о к Я

+ I й

И

7()! 545

Таблица 2

Культура

При ме чан и е: (+) — заметный рост (— ) — отсутствие роста, Формула изобретения ве микроорганизмов используют. бактерии popà

Bacillus штаммы У ййй1 В-8065 или

Ййй(В-8066.

2. Способ по п. 1, . отличающийся тем, что в питательную среду вводят соль марган25

1. Способ получения биомассы, предусматривающий выращивание микроорганизмов в условиях аэрации на питательной среде, содержащай окисленные утлеводороды в качестве источника углерода, источник азота и необходимые минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, выращивание осуществляют при 45 — 65 С, при этом в качестСоставитель A.Áðàæíèêîâà .

Техред Л.Алферова Коррект эр О.Ковинская

Редактор Е. Дайч

Заказ 7410/43 Тираж 526 Подписное, ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

NRRL В-1001

NRRL  †11 .АТСС 12987

NRRL В 1168

NRRL В 1102

АТСС 10774

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР Р 553281, кл. С 12 D 13/06, 1974.