-пептидилтиогликозиды ацетил- -глюкозамина в качестве лигандов в аффинной хроматографии

-пептидилтиогликозиды ацетил- -глюкозамина в качестве лигандов в аффинной хроматографии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Cole3 Советских

Соцналнстнческнх

Республик

7{)2030

3), уf (61) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заявлено 100577 (21) 2497 024/23-04 с присоедименнем заявки М (23) Приоритет

Кл2

07 Н 15/14//

07 G 7/02

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 05.12.79 Бюллетень Но 45

Дата опубликовании описании 08.12.79

УДК 547. 455 (088. 8) (72) Авторы изобретения

А,А, Артюков, НиВ, Молодцов и В.Г, Лемеха

Тихоокеанский институт биоорганической химии AH СССР, Дальневосточный научный центр (71) Заявитель (5 4 ) P-ПЕПТИДИЛТИОГЛИКОЗ ИДЫ N-AUETEIJI-D-ГЛЮКОЗАМИНА

В КАЧЕСТВЕ ЛИГАНДОВ В АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

СНтОИ

$ — 3, HO

СоЕн 1О

Настоящее изобретение относится к новым соединениям — P -пептидилтиогликоэидам N-ацетил -D-глюкозамина общей формулы Ia: где I R = - CH7CONHCEIgCONHCHgCONHNHg

II R = - CH7CONHCHgCONHCHgCONHCHg ОИНИН

III R = - Сн,СОИНМН

IV R = — CHg CONHNHCOCH7CH COOH в качестве лигандов в аффинйой хро. матографии. -Пептидилтиогликозиды N-ацетил- 2р

-D-глюкоэамина являются конкурентными ингибиторами N-ацетил-р-D-гексоэаминидаэы (К.Ф. 3.2,1,52) и могут быть использованы в качестве биоспецифических лигандов в аффинной хрома- 25 тографии и при изучении механизма действия этого фермента, а также в биоспецифической хроматографии N-ацетил-D-глюкозамин спецйфических лектинов, Известны S- u N-алкил- и арилгликозиды N-ацетил-D-глюкоэамина (1), применяющиеся в аффинной хроматографии N-ацетил-)з-П-гексозамннидаэы (K.Ф, 3.2,1.52). Агликоновая часть укаэанных 1о-гликоэидов N-ацетил-D-глюкоэамина представляет собой молекулы гидрофобного характера. Это обстоятельство препятствует использованию таких биоспецифических лигандов в аффинной хроматографии N-ацетил-pD-гексоэаминидаэы из-эа большого сродства этого фермента к гидрофобным молекулам, присоединенным к водонерастворимым полимерам.

Высокая способность N-ацетил-D-гексозаминидаэы связываться с указанными лигандами приводит к необходимости использовать при элюции этого фермента буферы со щелочным значением рН (рН 8"10), что приводит к возможной инактивации фермента во время элюции.

Кроме того наличие в известных р-гликозидах концевых амино- и карбоксйльных групп дает воэможность присоединять эти соединения только к бромциан-активированным полимерам, что приводит к .получению сорбентоэ

702030 с сильновыраженными ионнообменными свойствами .(2) ., Целью настоящего Изобретения яв ляется получение новых Р-пептидилтиогликозидов N-ацетил-.-D-глюкозамина общей формулы .Ха, в качестве лигандов в аффинной хроматографии, которые представляют собой гликопептиды природного строения, не содержащие агликоны с гидрофобными свойствами, Природное строение описываемых гликопептидов позволяет исключить побочные явления при использовании. их в качестве лигандов в аффинной хроматографии и расширить арсенал биоспецифических сорбентов, Данные соединения можно получить путем ряда превращений хлоргидрата

2-S -(1,2 -дидезокси-1 -био-2 -ацетамидо-3,4,6 -три-О-ацетилен-Пглюкопиранозил)-2-псевдотиомочевины, который алкилируют монобромуксусной кислотой в водно-ацетоновом растворе карбоната калия и бисульфата натрия и получают S-карбоксиметил .,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил-p-D-глюкопиранозид.

При алкилировании исходного соедине-, ния этиловым эфиром монобромуксусной кислоты в этих же условиях получают этиловый эфир S-карбоксиметил-1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3 4 6/ Р

-три-О-ацетил-р-D"ãëþêîïèðàноз ида.

Затем проводят конденсацию S-карбоксиметил-1, 2-дидезокси-1-,тио-2-ацетамидо-3, 4, 6-три-О-ацет ил- D-глюк опиранбзида с метиловыми эфирами глицил" глицина и триглицина в воднотетрагидрофурановом растворе, например, в присутствии карбодиимида.

Выделенные:метиловые эфиры Я .(1,2-дидезжси-.1-тио-2-ацетамидо-3 4,6-три-О-ацетил- P-D-глюкопиранозил)—

»тиоацетилглицилглицина и Я-(1,2-дидезокси-1-тио-2 -ацетамидо-3,4,б-три-О-ацетил-QD-глюкопираноэил)-тиоацетилглицилглицилглицина обрабатывают безводным гидразином в абсолютном метаноле и получают соответствующие дезацетилированные гидразиды I,è II °

Гидразинолизом в этих же условиях. этилового эфира S-карбоксиметил-1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3 4,6- .

-три-О-.ацетил- -0-глюкопиранозида получают S-(1,2-дидезокси-2-тио-2-ацетамида +D-глюкойиранозил)-тиоацетилгщф>изид III. Сукцинилированием соединения III янтарным ангидридом в водно-метанольном растворе получают N-сукцинилгидразид S-(1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-QD-глюкопиранозил)-тиоуксусной кислоты (ХУ), Пример. Для синтеза ) -петидилтиогликозидов N-ацетил-D-глюкозамина необходимо получить следующие исходные соединения:

1, Я-Карбокоиметил-1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,б-три-О-ацетил- +D-глюкопиранозид.

К раствору 2 r (4 5 ммоля) хлоргидрата 2-S-(1 2 -дидезокси-1 -тио/

f

-2 -ацетамидо-3,4,6 -три-0-ацетил— рр-глюкопиранозил)-2-псевдотиомочевины в 16 мл водно-ацетоновой смеси (1:1) прибавляют при перемешиьании

0,75 г (5,3 ммоля) монобромуксусной кислоты, 1,8 мл 2,7 M раствора (4,8 ммоля) бисульфата натрия и

1,2 r (9 ммоля) карбоната калия. Смесь перемешивают 2 ч при 20-22;, подкисляют 2н соляной кислотой до рН 1,02,0 и полученный раствор насыщают хлористым натрием, Продукт реакции экстрагируют хлороформом (2x10 мл) и органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. Хлороформ упаривают дОсуха и ОстатОк перекристз л» лизовывают из смеси метанола с абсо лютным эфиоом. Полученный S-карбоксиметил-1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,б-три-О-ацетил-p-D-глюкопиранозид имеет.т.пл. 188, (/ равен

63 (с 0,39, хлороФорм). Выход

1 3 r (69%) °

Найдено,%: С 45,62; H 5,67;

N 3,03; S 7,60;

С 6 Н ИО, Я .

ЗО Вычислено,Ъ: С 45,59; Н 5,59;

N Зр32; S 7 60

2. Метиловый эфир S-. (1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,б-три-О-ацетил-Р-Р-глюкопиранозил)-тиоацетилЗ5 глицилглицина.

К раствору 0,35 г (1 9 ммоля) хлоргидрата метилового эфира глицилглицина в 25 мл 90% водного тетрагидрофурана прибавляют 0,32 мл

40 (2,2 ммоля) триэтиламина, 1 г .,(2,3 ммоля) Я-карбоксиметил-1,2-дидеэокси-1-тио-2-ацетамидо -3,4,б-три-О-ацетил- -D-глюкопиранозида и

0,66 г (3,2 ммоля) дициклогексилкар45 бодиимида, Реакционную смесь перемешивают 2 ч при 2-5 и 16 ч при 2022, добавляют 25 мл воды и выпавшую дициклогексилмочевину удаляют фильтрованием, Объединенный фильтрат и промывные воды экстрагируют хлороформом (Зх15 мл), органический слой промывают 3%-ным раствором (15 мл) бикарбоната натрия, разбавленной соляной кислотой (15 мл) и водой

55 (15 мл) ° Сушат над безводным сульфатом натрия, хлороформ упаривают и остаток хроматографируют на колонке с силикагелем (15 1 см), Колонку последовательно промывают эфиром, смесью этилацетата с эфирОм и этилацетатом. Фракции, элюированные этилацетатом и содержащие продукт реакции, объединяют, растворитель упаривают досуха и остаток кристаллизуют из эфира. Полученный метило702030

30 вый эфир S- (1, 2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3, 4, 6-три-0-ацетил-QD-глюкопираноэил) -тиоацетилглицилглицина имеет т.пл. 163" /Ы / о - 44,5 (с 0,25, этанол) . Выход г (79%) °

Найдено,Ъ: С 46,23; Н 6,02; 5

N 7,19; S 5,56»

С „Н „NgO„: S „

Вычислено,Ъ: С 45,91; Н 5,69;

N 7 65; $5,83 °

3 ° Метиловый эфир S-. (1,2-дидезокси-l-тио-2-ацетамидо-3,4,б-три-О-ацетил-р-D-глюкопиранозй )-тиоацетилглицилглнцилглицина.

Условия получения и выделения конечного продукта аналогичны п, 2 °

Из 0,7 (2,3 ммоля) хлоргидрата метилового эфира глицилглицилглицина, 0,32 мл (2,,3 ммоля) триэтиламина, 1 r (2,3 ммоля) S-карбоксиметил-1,2-дидезокси-l-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил-р-Р-глюкопираноэица и

0,66 (3,2 ммоля) дициклогексилкарбодиимида получают метиловый эфир S»

†(1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил- -Р-глюкопиранозил)-тиоацетилглицилглицилглицина., т,пл, 187-188О /сС/ о - 107,5О(с 0,23 этанол). Выход 1 г (72%), Найдено,Ъ: С 46,05; Н 5,42у

N 9,16; S 5,12;

С Н 94Н40, з S °

Вычислено, Ъ: С 45, 77; Н 5, 18;

N 9,28; S 5,31 °

4. Этиловый эфир S».(1,2-дидезокси-l-тио-2-ацетамидо-Ç, 4, б-три-О-ацетил- pD-глюкопираноэ ил) -тиоуксус- 35 ной, кислоты.

К раствору 29 г (65 ммоля) хлор,гидрата S- (l, 2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-3 4, б-три-О-ацетил-(-D-глюко-. пиранозил) -псевдотиомочевины в 200 мл40 водно-ацетоновой смеси (1: l) при .йеремешивании прибавляют 8,6 мл (73 ммоля) этилового эфира монобромуксусной кислоты, 24 мл 2;7 М раствора (65 ммоля) бисульфита натрия и 45

8,9 r (65 ммоля) карбоната калия, Смесь перемешивают 2 ч при 20-22, разбавляют 150 мл воды и продукт реакции экстрагируют хлороформом, Экстракт промывают 3%-ным раствб- 50 ром бикарбоната натрия (30 мл) водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Хлороформ упаривают и остаток кристаллизуют из ЗЗЪ водного метанола. Полученный этиловый эфир S- 55

-карбоксиметил-1,2-дидезокси-l-тио-2-ацетамидо-3,4,б-трн-О-ацетил-(-D-глюкопираноэида имеет т,пл, 158

/с(/ - 70 (с 1, этанол) ° Выход

28 r (97%) . 60

Найдено,Ъ: С 47,91; H 6,14;

N 3,12; S 7,13, С 16 й„мо,Я.

Вычислено,%: С 48 10; Н 6,05;

N 3.12; S 7,,09. 65

Затем проводят синтез непосредст" венно р-пептидилтиогликоэидов N»ацетил-D»глюкозамина.

1. Гидразид S-(1,2-дидеэокси-l-тио-2-ацетамидо- -D-юлюкопиранозил)-тиоацетилглицилглицина, К раствору 1. г (1,3 ммоля) метило-. вого эфира S-(1,2-дидезокси-l-тио-2-ацетамидо-3,4.6-три-О-ацетил-P-D-глюкопиранозил)-тио-ацетилглицилглицина в 10 мл абсолютного метанола при перемешивании прибавляют 0,3 мл (10,8 ммоля) безводного гидразина, Смесь перемешивают при 20"22 в течение 20 ч, Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают абсолютным метанолом и сушат, Полученный продукт реакции имеет. т.пл. 219-220

Id./ - 103 (с 0,13, метанол: вода

2..1) Выход 0 68 r. (89%) ° . найдено,В: С 39,98; Н 6,08; и 16,48; S 7,40 °

С 4 Н NgOgS °

Вычислено В: С 39,70; Н 5,9бу

N 16,54; S 7i57 °

II. Гидразид S-(1,2-дидеэокси-l-тио-2-ацетамидо-p-D-глюкопиранозил)-тиоацетилглицилглицилглицина, Гидпаэинолизом 1 г (l,б ммоля) метилового эфира S-(1,2-дидезокси-l-тио-2-ацетамидо-3,4,б-три-О-ацетил-р-D-глюкопираноэил)-тиоацетилглицилглицилглицина в условиях, аналогич- ных п.l, получают укаэанный продукт т.пл, 225-.226, /с / - 47 (с 0,18 метанол:вода - 2:1) ° Выход 0,58 r (75%) °

Найдено,Ъз С 40 22 H 5,98р

N 17i73; S 6i82

С(Ь Н ЗНЬОфЯ

Вычислено,Ъ: С 39,99; Н 5,88;

N 17,49; S 6,67 °

III. Гидразид S-карбоксиметил"1,2-дидезокси-1-тио-ацетамидо-p-D-глюкопираноэида.

Гидразинолизом 4,5 r (10 ммолей) этилового эфира S-карбоксиметил-1-тио-2-ацетамидо-3,4,6-три-О-ацетил.,(-D-глюкопираноэида s условиях, аналогичных и, 1, получают указанный продукт, т,пл, 247-249" / / в — 58" (с 1, вода.) ° Выход 3,0 r. (96%) ., Найдено,Ъ: С 38,99; Н 6,12;

N 13,55; Я 10i28 °

С„Н„ N O S

Вычислено,%: С 38,83; Н 6,19;

N 13,58; S 10 27.

1 ° N-Сукцинилгидразид Я- (1, 2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-) -D-глюкопиранозил) -тиоуксусной кислоты.

К раствору 3,1 r (10 ммолей) гидразида S-карбоксиметил-1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо- Ъ-D-глюкonupaноэида (III) в 85 мл охлажденного до 0 66% водного метанола прибавляют раствор 1,2 r. (12 ммолей) янтарного ангидрида в 25 мл хлороформа, 70 >030

Формула изобретения

Смесь перемешивают 2 ч при 20, Выпавшие кристаллы отфильтровывают,промывают метанолом и наерекристаллизовывают из 50% водного метанола, Полученный N-сукцинилгидразид S-(1,2-дидезокси-1-тио-2-ацетамидо-p-D-глюкопиранозил)-тиоуксусной кислоты имеет т,пл. 222"224 /с /> — 41 (с 0,1 этанол: вода - 1:1) . Выход

3,5 г (85%.), Найдено,% ° С 41,20; H 5,94;

N 10р 08; S 7,92.

С Н, NÄO S Ä

Вычислено, В: С 41,06; Н 5,67 у

N 10р26; S 7р82 °

Р -Пейтидилтиогликозиды N-ацетил-D-глюкоэамина, синтезированные описанным способом могут быть использованы в биохимическом производстве и лабораторных исследованиях .для получения. чисто биоспецифических сорбентов, необходимых для выде,ления и очистки некоторых агглютинирующих белков и N-ацетил-pi--б=гексоэа минидазы, а также для )кинетическо,— го исследования механизма действия этого фермента. р-Пептидилтиогликозиды-N-ацетил-D-глюкозамина общей формулы

Сн ОН

$-R нСоСн где I R = - CHgCONHCH CONHCH CONHNHq

II R СН СОИНСН СОННСН CONHCH соннйН

»1 Н = - СН CONHm

Iy R = - СН СОИНИНСОСН СН СООН в качестве лигандов в аффинной хроматографии.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. ApTMKOB A.À. Молодцов Н.В, Синтез тиогликоэидов. Аффйнная хроЮ матография Л-ацетил-P-D-гексозаминизы . Биоорганическая химия 1, (II), с, 1577 (1975).

2.Tost R., A ronТЛ/1Гсйе,1< М.,"The yoge

25 у assort ttl1on оу proteins to abpthatic

and aromatic arnines оир6ед 1о g anogen

„Ь ов йе-цс1ivat ed qpqrose" В iochern Bioраз A&a 362,75(1974) Co" тавитель JI. Никулина кеасаз Б." Ко екто Т. Скворцова

Заказ 7535/27 - . Тираж 513 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра яаская ааа. а 4 5

Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул. Проектная, 4