Клеточная линия тимуса эмбриона крупного рогатого скота мва- 76 "продуцент" онкорнавируса типа с(тэк-мва-76)

Клеточная линия тимуса эмбриона крупного рогатого скота мва- 76 "продуцент" онкорнавируса типа с(тэк-мва-76)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советееа

Социалистии вам

Рвспублик (i»702073 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 20.06.78 (21) 2630956/30-15 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. Кл2.

С 12 К 9/00

Гасударственный квинтет

СССР по делан извбретвннй н вткрытнй

Опубликовано 05.12.79. Бюллетень № 45 (53) УДК 578.085. .23:591.044 (088.8) Дата опубликования описания 15.12.79

В. А. Крикун, Т. В. Лебедева, 3. Н. Меньшикова, В. П. Шишков, Б. 3. Иткин и Г. С. Петровский (72) Авторы изобретения

Московский ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия имени К. И. Скрябина (7I ) Заявитель (54) КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ ТИМУСА ЭМБРИОНА

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МВА-76 — ПРОДУЦЕНТ

ОНКОРНАВИРУСА ТИПА С(ТЭК-МВА-76) 1

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, конкретно к культивированию тканей для получения вирусных препаратов, и представляет собой новую перевиваемую линию клеток «продуценть онкорнавируса типа С, используемого для размножения онкорнавируса, а также для приготовления онкорнавирусных антигенов для серологических реакций и для специфической профилактики онкорнавирусной инфекции.

Известны краткосрочные культуры лейкоцитов лейкозного скота, которые продуцируют частицы онкорнавируса, что имеет неоспоримую ценность в изучении онкорнавируса типа С крупного рогатого скота (1) и (2).

Однако низкий уровень продукции вируса и дегенерация клеток, сопровождающая высвобождение вирусных частиц, сильно затрудняют процесс концентрации и очистки вируса. Кроме того, эти культуры позволяют получать только внутренний вирусный антиген с молекулярным весом 24000 дальтон, который в серологических реакциях выявля2 ет не всех животных носителей онкорнавирусной инфекции.

Описанная Феррером линия клеток NBC, полученная из лимфоцитов лейкозного животного и выращиваемая в виде суспензионной или монослойной культуры, продуцирует частицы онкорнавируса крупного рогатого скота типа С, выявляемые с помощью электронной микроскопии и иммунофлуоресцентным методом (3).

Однако низкая продукция вируса этими l0 клетками не позволяет получать его в препаративных количествах для последующей концентрации и очистки.

В нашей стране выведена перевиваемая клеточная линия селезенки плода лейкозной коровы, которая может быть использована, в частности, для изучения онкорнавирусов крупного рогатого скота (4) .

Однако эта линия клеток не является

«продуцентом» онкорнавируса крупного рогатого скота или его антигенов.

20 Наиболее близкой по своим полезным свойствам к предлагаемой линии является однослойная культура клеток селезенки плода овцы, инфицированная онкорнавирусом

4D — 7

3 крупного рогатого скота, полученная в США доктором Ван дер Маатеном (5J

Эти длительно пассируемые фибробластоподобные клетки продуцируют онкорндвирус и онкорнавирусные антигены и используются для накопления и концентрации вируса и антйгенов с целью изучения их свойств и использования в серологических реакциях.

Однако эти длительно пассируемые клетки не являются перевиваемой линией и, сле— довательно, не могут размножаться неопределенно долго; и в процессе старения обречены на вырождение, кроме того, они заражены штаммом онкорнавируса, выделенным в США от "местного крупного рогатого скота, больного лейкозом, что ограничивает возможности исследования этих клеток для изучения вирусологических аспектов лейкоза в нашей стране. Клетки селезенки плода овцы выращиваются на питательной среде, содержащей 20% сыворотки плода коровы, которая не выпускается в промышленных масштабах в нашей стране.

Целью изобретения является линия перевиваемых клеток, хронически инфицированная отечественным штаммом онкорнавируса крупного рогатого скота, интенсивно продуцирующая онкорнавирус и онкорнавирусный антиген и обладающая способностью хорошо репродуцироваться на отечественной питательной среде с коммерческой сывороткой крупного рогатого скота, служащая надежным источником онкорнавируса и онкорнавирусного антигена для изучения вирусологических аспектов лейкозов крупного рогатого скота.

На рис. 1 представлена электронная микрофотография клеток линии МВА-76; на рис. 2 — микрофотография вирусных частиц типа С.

Клеточная линия тимуса эмбриона коровы МВА-76, инфицированная отечественным штаммом онкорнавируса крупного рогатого скота, продуцирующая как онкорнавирус, так и растворимые онкорнавирусные антигены, имеет следующие морфологические и физиолбгические характеристики.

Клетки МВА-76 растут на поверхности стекла в виде однослойной культуры. По морфологии клетки культуры МВА-76 однородны и имеют фибробластоподобную форму с круглым или овальным ядром, содержащим 1 — 4 ядрышка округлой формы.

Пример. Клетки культивируются iri vitro при 37 С в питательной среде, состоящей из среды Игла и 10% сыворотки крупного "рогатого скота.

Оптимальная плотность посадки составляет 15 Х 104 клеток в 1 мл среды. Монослой формируется на 4 — 5 суток. В процессе созревания культуры происходит постепенное закйсление среды. С поверхности стекла клетки хорошо снимаются подогретым до

37 С 0,02%-ным раствором Версена. Клетки

02073 . обладают хорошей адгезивной способностью, пересеиваются 1 раз в неделю. Коэффициент пересева равен 1: 3 — 1: 4. Линия клеток не контаминирована микоплазмами и цитопатогенными вирусами.

Линия перевиваемых клеток тимуса эмбриона коровы МВА-?6, хронически инфицированная онкорйавирусом крупного рогатого скота, получена путем сокультирования кле ток тимуса эмбриона коровы на 4 пассаже с лейкоцитами крови лейкозной коровы, ин10 фицированной онкорнавирусом крупного рогатого скота. В процессе пассажей (на уровне 30 пассажа) морфология клеток стабилизировалась. Клетки имеют фибропластоподобную форму (рис. 1) и продуцируют в питательную среду онкорнавирус крупного рогатого скота и вирус — индуцированный антиген. Продуцируемый клетками онкорнавирус идентичен исходному вирусу, использованному для заражения клеток, имеет под электронным микроскопом типичную для

И вирусных частиц типа С морфологию центрально расположенный электронноплотный нуклеотид отдельный от двухслойной оболочки просветом. Размер нуклеотида ,составляет 60 — 80 нм, а всей вирусной частицы 120 нм (рис. 2). Продукция онкорнавирусного антигена этой культурой выявляется с помощью реакции иммунодиффузии в агаровом геле с использованием тест-системы для идентификации онкорнавирусных антигенов (сыворотка крупного рогатого

М скота, содержащая антитела к гликопротеидному антигену вирусной оболочки и онкорнавирусный гликопротеидный антиген) .

Технико-экономическая или иная эффективность.

Клеточная линия тимуса эмбриона коровы МВА-76 — продуцент онкорнавируса крупного рогатого скота интенсивно продуцирует онкорнавирус и онкорнавирусные антигены. Продукция вируса в этой клеточной системе значительно более высокая, чем в краткосрочных культурах лейкоцитов лейкозных животных. Нативная культуральная жидкость шестисуточной культуры клеток

МВА-76 может быть использована в реакции связывания комплемента в качестве антигена для выявления онкорнавирусных антител у инфицированных животных. В отличие от краткосрочных культур перевиваемые клетки МВА-76, продуцируя вирус, не разрушаются и не загрязняют клеточными обломками вирусный материал, что существенно облегчает процесс концентрации и очистки вируса и вирусных антигенов.

Преимуществом перевиваемой линии клеток МВА-76 является то, что она хронически инфицирована отечественным штаммом онкорнавируса и культивируется на отечественной питательной среде с сывороткой крупного рогатого скота. Концентрация жидкой фазы культуры клеток линии MBA-76

702073

Формула изобретения фиг,7 позволяет получать онкорнавирусные антигены, используемые в реакции иммунодиффузии в агаровом геле для выявления животных носителей- онкорнавирусной инфекции и для эпизоотологической оценки хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота.

Перевиваемая линия клеток МВА-76 может быть использована для биофабричного производства онкорнавирусных антигенов.

Клеточная линия тимуса крупного рогатого скота МВА-76-продуцент онкорнавируса типа С (ТЭК-MBA-76)-хранится в коллекции

Московской ордена Трудового Красного 1

Знамени ветеринарной академии имени

К. И. Скрябина.

Морфологические признаки. Фибропластоподобные, отросчатые вытянутой формы клетки. Ядро овальной или округлой формы расположено эксцентрично. В популяции преобладают клетки с гетероплоидным набором хромосом.

Физиологические признаки. Клетки культуры растут в виде монослоя в среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, не содержащей антител к онкорнавирусу крупного рогатого скота. Оптимальная плотность посева составляет

15 Х 104клеток/мл. Монослой формируется на 4 — 5 сутки. С поверхности стекла снимаются 0,02% раствором Версена. Индекс Э посева составляет 1: 3.

Дополнительные признаки. Линия хро. нически инфицирована онкорнавирусом типа С, в цитоплазме клеток и в межклеточном пространстве образуются вирусные частицы типа С с.центрально расположенными электронноплотным нуклеотидом, отделенным от двухслойной оболочки просветом. Размер нуклеоида составляет 60 — 80 нм, а всей вирусной частицы 120 нм. Клетки продуцируют в питательную среду полный вирус, а также вирусиндуцированные антигены, выявляемые в реакции связывания комплемента и реакции иммунодиффузии в агаровом геле. Интенсивная продукция вируса и вирусных антигенов позволяет использовать нативную культуральную жидкость в качестве антигена для РСК и реакции иммунодиффузии в агаровом геле с целью выявления животных вирусоносителей и эпизоотологической оценки хозяйств по лейкозу.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Шишков В. П., Кукайн P. А.-Н., Нагаева Л. И., Крикун В. А., Кумков В. Т., Иткин Б. 3., Брацлавская О. И. и Лебедева Т. В. Выделение онкорнавируса типа С (штамм ЛЛ МВА-1) от крупного рогатого скота с персистентным лимфоцитозом. Доклады ВАСХНИЛ 1977, 5, 20.

2. 1. M. Miller, С. Olson, 1. Nat. Cancer

Inst. 1972, 49, 1459 — 1462.

3. 1. F. Ferier, N. D. Stok. P. Lin, 1. Nat.

Cancer Inst. 1971; 47, 613 — 621.

4. Авторское свидетельство СССР № 578338, кл. С 12 К 9/00, 1977.

5. М. I. Чап der Maaten, 1. М. Miller, А. D. Boothe, 1. Nat. Cancer Inst. 1974, 52,491 — 497 (прототип) .

Составитель М. Белоусова

Редактор Л. Курасова Техред О. Луговая Корректор Е. Папи

Заказ 7542/29 Тираж 526 Подписное

ЦН И И П И Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ж — 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал П П П а Патентл, г. Ужгород, ул. Проектная, 4