Способ получения макромолекулярных производных аденина

Способ получения макромолекулярных производных аденина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (6l ) Дополнительный к патенту (ill 704455 (51} мз. КЛ.

С 07 D 473/34

С 07 D 405/14

A 6l К 37/48 (22) Заявлено1001.77 (21) 2381802/

/2437052/23-04 (23) ПРиоРитет15Д776(32} 04.05.76

Государственный комнтет

СССР но дедам изобретений н открытнй (3l) 22958A/76 (33) Италия

Опубликовано151279. Бюллетень М 46

Дата опубликования описания 151279 (53} УДЫ 547«857«

° 7 ° 07 (088 ° 8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Пьерджорджо Дзаппелли, Антонио Роззодивита, Розарио Напра и Лучано Ре (Италия) Иностранная фирма Снампрогетти, С.П.А- (Италия) (7Ц Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ

ПРОИЗВОДНЫХ АДЕНИНА

Изобретение относится к способу получения новых производных аденина которые могут найти применение в хроматограФии и в качестве коферментов. 5

Известна реакция ацилирования ами- МН нопроизводных карбоновыми кислотами в присутствии карбодиимидов (1), Цель изобретения — способ получения новых производных аденина, обла- 10 дающих ценными свойствами.

Поставленная цель достигается способом получения макромолекулярных производных аденина общей формулы

1%Н2

М X

З-S — (СН ) — С00?1, 2 fl

И, _#_ N . $ — (CM1 — С вЂ” А1

П

R, где A — радикал N-полиэтиленимина

N-полилизина, N-.-аминогексилсефарозы и — радикал формулы

0 0

Ж

ll П 0

СН 0 — 7-0-P-ОН C м" ! l

Ri0 0?I

0Е 0Н

003I1i

2 «В

R<- водород или группа Н Ю .п-2 или 3

Способ заключается в тсм, что соединение общей формулы где R и и имеют указанные значения, подвергают взаимодействию с соединением АН, где A имеет указанные значения.

Способ по изобретению предпочтительно осуществляют в присутствии карбодиимида в воде или смеси волы с водорастворчмым органическим расто ворителем при температуре 5-50 С.

Пример 1« Получение никотиноиламид-8-(полиэтиленимин-3-карбонилэтилтио) алениндинуклеотида.

К 0,76 мл водного раствора полиэтиленимина (ЗЗВной концентрации вес/об), с рН 5 (указанное значение рН получают добавлением концентрированной соляной кислоты) приливают раствор 39 мг никотиноиламид-8704455, {карбок:иыилl lo) адениидиетук.!еа:тида (НАД) в 0 р 5 мл HОДы и paстВОР

40 мг гядрохл!Орида Ы-этил-N -{3-диМЕТИЛаМИНОПРОПИЛКарботтИИ1!Ида Н

0,5 мл воды.

Реакционную смесь доводят да РН

4,8 добавлением 2М соляной кислоты и перемешивают 48 ч при комнатной температуре поддержиная РН 4,8 в первые 3 ч добавлением 0,1N соляной кисЛОты. Затем реакционную смесь доводят водой да 20 мл, переносят н центрифужную пробирку и осаждают

20 мл 1М, Фосфатного буфера с РН 6Центрябугируют 20 мин при 39000 аб/мин и раствор отделяют от полимерного осапка декантацией.

С целью цальнейшей очистки осадок растворяют в 4 мл смеси 2 N

РасТвора хлористого натрия и 0,05N ацетатного буфера с РН 5,5. К по= лученному раствору приливают 16 мл 20 вода и вновь осаждают 20 мп 1М ФосФатного буфера с ОН 6 и центрифугируют 10 мин IIDH 39000 об/мин и собирают осапок путем декантации, Подобную операцию Очистки про- 35 водят минимум.4 раза.

Вещество, растворенное н 2М растворе хлористого натрия и 0,5М аце-. татном буфере с РН 5,6, диализируют, (гтротив двух порций 1 10 4М соляной . q() кислоты в течение четырех дней. Меняя Раствор каждый день.

Лиофильная сушка остатка после диализа дает 223 мг полимерного производного НАД,7,„276 нм.

Определение всего НАД, связанного с полимером, асущестнляют пф тем измерения поглощения при 276 ° 5 нм, принимая коэффициент экст1лнкцяи. Рав иьтм коэффициенту производного НАД

"(Я 18800 М см ") . $Q

Определение коферментноактявного

НЛД, снязанйога с полимером, проводят путем количественного Феоментативнаго восстановления спиртоной пегидрагеназой дрожжей в 0,1м трис-буфе-45

Ре с РН 9 в присутстния 0,2М этанола и 0,5N гидрохлорида семикарбазида.

Из спектрофотометрических измеРений при 340 нм образовавшегося производного НАД слелует, что 50

115 мк/молей ферментативно восста. новленного НАД связано с 1 г полимера, что соотнетстнует 90Ъ всего

НЛД, связанного с полимером.

П Р и м е р 2. Получение никотинаиламид-8-(полилизин-2-карбонилэтилтио)-адениндинуклеотида.

К раствору 50 мг гидробромида полилизина с мол. весом 50000 в 0,5 мл воды приливают 40 мл някотиноиламид" 6О

-8-(карбоксиэтилтио)адениндинуклеатида (НАД) в 0,5.мл воды и раствор 40 мг гидрохлорида N-этил-N †(3-диметиламинопропил)карбодиимида в О, 5 мл воды.

Реакционную смесь доводят 0,1 N раствором едкого натра до РН 4,7 и

1 ереме((1õòòàþ.: -. . ч 1;pir кОмнатной тг м пераTурет ИОддержявая первые 3 ч РН

4„7 добавлением 0,1 М соляной кисЛОТЫ.

При тех же условиях вносят сще раствор 40 мг карбадиимида в 0,5 мл воды и ;!Родолжают перемешивать 24 ч.

Реакционную смесь данодят водой да 15 мл, переносят н центрифужную пробирку и осаждают .1.0 мл 0,15 М

ФОсфатнОгО буфера с РН 6о

Центрифугируют 10 мян при

1900 об/мин я декантлруют раствор от ссадка.

С целью дальнейшей очистки целевого продуктaего растворяют н 1 тля с тесн 2 М раствора хлористого натрия и 0,05 M ацетатного буфера с рН 5,5 и к полученному раствору приливают

15 мл воды и вновь осаждают 10 мл

0,,15 М Фасфатным буфером с РН 6, и . фугуют 10 мян при 39000 об/мин, собирая осадок декантацией*

Подобнук процедуру очистки проделывают минимум 4 раза. Вещество, раст" варенное н 2М растворе хлористого натрия и 0,05М ацетатном буфере с .

РН 5,5 диализируют 48 ч против 500 мл

ЗМ раствора хлористого натрия.

Диализ ведут против 2 мал порций 1 10 М лсоляной кислоты четыре дня, возобновляя растнор ежедневна

Д(лофильная сушка остатка после дяаЛИЗа даЕт 34 Г Пат -"МЕРНОГО ттраиэнод1 этгг; НЛЦ,(, 2 . 6, 5, ti,т, Определение всего НЛД„связанного ,с полимером, осуществляют изтлерением поглощения при 276,5 нм, принимая коэффициент экстинции, ранным коэффициенту для праизноднога НЛД ((-л 1 (18000 М см ). Определение каферментноактинного НАД, связанного с полимерам, проводят количественным Ферментатинным восстановлением спиртовой дегядрагеназай дрожжей в

0,1М тряс-буФере при РН 9 в присутствии 0,2М этанала и 0,05М гидрохлорида семикарбазида.

Из сг!ектрафотометрического измерения при 340 нм полученного производного НЛД следует, чта 157 мкмолей ферментативно восстанавливае-мого НЛД связано " 1 г полимера, что соответствует 90% всего НЛД, связанного с полимером.

Пример 3. Получение никотинояламид-8-(аминогексялсефароза-2-карбонилэтилтио)адениндинуклеотидаc

500 мг амтлногексилсефарозы 4В оставляют набухать в 0,5 М растворе хлористого натрия, затем промывают

200 мл 0,5 М раствора хлористого натРия и затем водой. К полученному гелю, взмученному н 2 мл воды, приливают раствор 40 мг никотиноиламид-8-{карбоксиэтилтиа)адениндинуклеОтида (НАД) в От5 мл БОды и ДОРО дят до рН 4,7 с помощью 1М едкого натра. К смеси при комнатной температуре приливают раствор 40 мг гидS рохлорида N-этил-N †(3-диметиламинопропил)карбодиимида в 0,2 мл = oäû и продолжают перемешивать 24 ч, поддерживая рН 4,7 в течение первых

3 ч добавлением 0,1М соляной кислоты.

В тех же условиях приливают с

24-часовыми интервалами три дополнительных порции раствора карбодиими" да (40 мг в 0,2 мл воды, общая про"

10 должительность реакции 96 ч). Гель отфильтровывают, промывают 1М раствором хлористого натрия и 1 10 М НС1 до исчезновения уф-поглощени (несвязанного НАД). Таким образом получают 1,8 мл полимерного производного НАД в виде влажного геля, "макс 276 i5

Уф-спектр получают, суспендируя гель в 50%-ном водном растворе са- 2О харозы (вес/вес), препятствующем осаждению геля. Определение общего количества НАД, связанного с полимером, осуществляют измерением поглощения при 276,5 нм, принимая коэффи- 25 циент экстинкции, равным коэффициенту производного НАД (18800 М см ).

Определение коферментноактивного

НАД, связанного с полимером осуществляют количественным, ферментатив- Щ() ным восстановлением спиртовой дегидрогеназой дрожжей, суспендируя гель в 50%ном водном растворе сахаровы (вес/вес), содержащем 0,1N трис-НС1-буфер, 0,2М этанол и 0,5N гидро- З5 хлорид семикарбазида с рН 9.

Из фотометрических определений при 340 нм производного НАД следует, что 31 мфмоль ферментативно вос "

Ьтанавливаемого НАД связано с 1 г ®О сухого продукта, что соответствует

80% всего НАД, связанного с полимером.

Пример 4. Получение никотиноиламид-8-(полиэтиленимин-2-карбонилэтилтио) -адениндинуклеотидфосфата.

К 0,38 мл 333-ного водного раствора полиэтиленимина (вес/об), с рН

5 (полученного добавлением концентрированной соляной кислоты) приливают раст- вор 20 мг никотиноиламид-8-(карбокси- 5G этилтио)адениндинуклеотидфосфата (НАДР) в 0,5 мл воды и раствор 20 мг гидрохлорида И-этил-N †(3-диметиламй нопропил) карбодиимида B .0,2 мл воды.

Реакционную смесь, доведенную добав". Я лением 2М соляной кислоты до рН 4 8 перемешивают 24 ч при комнатной температуре поддерживая в первые 3 ч рН 4,8 добавлением 0,1 М соляной кислоты. В тех же условиях приливают дополнительно раствор 20 мг карбодиимида в 0,2 мл воды и продолжают перемешивать еше 24 ч Реак ционную смесь доводят водой до 10 мл и переносят в центрифужную пробирку и осаждают 10 мл 1М фосфатного буфера с рН о. центрнфугируют 10 мин при

39000 об/мин и раствор декантируют с осадка,,,Для дальнейшей очистки полимера его растворяют в 2 мл 2М раствора хлористого натрия в 0,05М ацетатном буфере с рН 5,5. К полученному раствору приливают $ мл воды и вновь осажцают 10 мл lYi Фосфатного буфера с рН 6 и центрифугируют при 39000 об/мин.Полимер собирают декантацйей, Эту процедуру очистки повторяют минимум 4 раза. Вещество, растворенное вновь в смеси 2М раствора хлористого натрия

0,05Yi ацетатного буфера с рН 5,5 диали-":rrðóþò против литровых порций 1 104М

НС1 в течение 4 дней, меняя раствор ежедневно. Лиофильная сушка остатка от диализа дает 83 мг полимерно" го производного НАДР,Л щ к 276,5 нм.

Определение всего НАДР, связанного с полимером, осуществляют измерением поглощения при 276,5 нм, принимая коэффициент экстинкции, равным коэффициенту производного НАд (E. 18000 М см ).

Определение коферментноактивного, НАДР/ связанного с полимером, определяют путем количественного ферментативного восстановления дегидро" геназой глюкоза-б-фосфата из дрожжей в 86,3 мМ триэтаноламиновом буфере, рН 7,6, содержащем 6 7 мМ хло" ристого магния и 1,2 мМ глюкоза-б-фбсфата. Из спектрофотометрическбго измерения производного КАДР.при 340 нм следует, что 23 мкмоля ферментативно восстанавливаемого НАДР связано с

1 г полимера„- что соответствует 203 всего БЛДР, связанного с полимером. формула изобретения

1. Способ получения макромолекулярных производных аденина общей форм лы

:.де А — радикал N-полиэтиленимина, N-полилизина, N-аминогексилсефарозы, R — - радикал формулы

0 м 9

О,Ф

СН О 1 — Î-Z-ОИ С (1

a,O GH . EO QE 00МИ

R,(- водород или группа Н РО„, и-? или 3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что соединение общей формулы и

1 (н ) -eooM

3. где В и п имеют указанные значе" ния подвергают взаимодействию с соединением АН, где A имеет указанные значения.

2 ° Способ по и. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что процесс

70445) проводя" в присутствии карбодиимида °

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю шийся тем, что процесс проводят в воде или смеси воды с водорастворимым органическим растворителем.

4. Способ по пп ° 1-3, о т л и ч а ю шийся тем что процесс проводят при температуре 5-50 C.

10 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Л. Физер, М. Физер, Реагенты для органического .синтеза, Мир, М.i 1970, т. 1, с.. 424.

Составитель A. Орлов

Реяакттдр Л» Емельянова Тех е ко екто И. шароши

Закаа 783б/49 Тираж 513 Подписное .ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113 35 Москва Ж-35 Ра ская наб. . 4 5

Филиал ППП Патент, r- Ужгород, ул. Проектная, 4 а