Способ количественного определения вируса в вирусных смесях

Способ количественного определения вируса в вирусных смесях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

„„7О4986

Ф ..I (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 090876(2) ) 2391940/28-13 с присоединением заявки М— (23) Приоритет— (51)М. Кл.

С 12 К 7/00

Госуддрстаенный «омитет

СССР яо делам изобретений и от«рытий (53) УДК 576.858 (088. 8) Опубликовано 251279. Бюллетень Ио 47

Дата опубликования описания 05.01.80 (72) Авторы изобретения

Л. Б. альберт, Г. A. Алпатова, Г. Л. Крутянская и Т. Ф. Журавель (71) Заявитель

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

Академии медицинских наук СССР (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА

В ВИРУСНЫХ СМЕСЯХ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается биологического контроля живых вирусных поливалентных вакцин.

Известен способ количественного определения вируса в вирусных смесях, включающий заражение культуры ткани, инкубирование ее с последующим нанесением питатель но-покров ного агара и определением концентрации вируса по количеству бляшек fl) .

Однако такой способ не обеспечивает. высокой чувствительности и точности определения.

11ель изобретения — повышение чув- 15 ствительности способа и точности определения.

Это.достигается тем, что культуру ткани заражают вирусной смесью и после инкубирования наносят питательно- 20 покровный агар, содержащий антисыворотки ко всем вирусам, кроме искомого.

Способ осуществляют следующим образом.

При титровании используют одно или 2 два разведения испытуемого материала.

На каждое разведение используют не менее трех флаконов с монослойными культурами первичных клеток в возрасте 6-8 дней. При . использовании фла- 30 конов емкостью 5,0-100 мл объем вводимого в них материала (инокулята)

0 1 мл, а для.флаконов емкостью

250 мл — 0,2 мл.

Перед заражением флаконы тщательно промывают питательной Средой или раствором Хенкса. После этого производят полное и тщательное удаление промывочной среды. После заражения флаконы выдерживают в течение 1-2 ч при температуре 22-37 С.

С целью полной .адсорбции вируса необходимо его равномерно распределить по всей поверхности монослоя клеток, для чего применяют периодическое (через 15-20 мин) покачивание флаконов. Через 2 ч зараженные и контрольные флаконы заливают питательным покровным агаром, в состав которого добавляют имунную типоспецифическую сыворотку или их смеси в заранее установленной концентрации. Эту концентрацию устанавливают так, чтобы имела место полная, нейтрализация гомологического штамма (штаммов) вируса при сохраненйи титра гетерологичного штамма,. Объем питательно-покровного агара для флаконов емкостью 100 мл—

10 мл, для флаконов емкостью 250 мл—

15 мл. После затвердевания питатель7049864 но-покровного агара флаконы перевора- Контроль на общее содержание ви"чивают агаровым покрытием вверх и ин- руса в исследуемой поливалентной вак-. кубируют при температуре 33-37 С, цине. Три флакона с культурой зара Рецептура питательно-покровного жают разведениями испытуемой вакцины, агара на 100 мл (зависит от природы как описано выше. Зараженные флаконы вируса и культуры ткани), мл: — 5 заливают питательно-покровным агаРаствор Эрла 10 9 .Ром, не содержащим имунные типоспе Дистиллированная вода 28 цифические сыворотки Установле и (30 мл б овленны с (мл беэ имунной в этом опыте вирусный титр не долже

ыворотки) . " отличаться более чем на 20% от с мн месь имуннйх сывороток 10 мы вирусных титров каждого компонен-. двух типов вируса 2 та поливалентной вакцины, УстановНормальная бычья"сы- .ленных в основном опыте. воротКа или обезжиренная : . Контроль на специфичность имунных

1,8 " " сывороток. Каждую примененную в ост я

Раствор бикарбоната н໠— . новном опыте имунную типоспецифичесрия (7,5%) 8,1 кую"сйворотку или их смесь исследуют

Нейтраль-рот 1/1000 1,5 . в рабочем разведении со стандартны3%-ный раствор расплав-", .... Ми вирусами всех серотипов, иэ котоленного агара ДиФко 50,4 " p состоит испытуемая вакцина. ВиОкончательный подсчет бланк про- Русы пРименяют в дозе, вызывакщей

"„я, „5 „...: 20 образование 30-50 бляшек во флаконе

КоличЕственное содержание отдель В oTcyTcTB HH имунных chlaopoTOK . В C JIy> Вкусных- компонентов в j мл ис- . чае гомологичных сочетаний сыворотки

" следуемой вакцины определяется сле- (сывороток) с вирУсом не должно обра:- дуюшим образом.: - . - - . зовываться..бляшек в течение срока наОпределяют среднее количество бля- 25 блюдения. шек в одном Флаконе в каждой опытной В случае гетерологичных сочетаний партии, собтветственно примененной сывороток с вирусом количество обра-. имуннбй ти сыворотке "эуемых бляшек не должно Уменьшаться

" ИЛИ"СМЕСИ тахиХ СйзсрОтОК. 6ОЛЕЕ ЧЕМ На 10% ПО СраВНЕНИЮ С тИЭто количество умножают на разве- . 30 тром" вируса, установленного в отсутдение вакциойной пробй и на ббратную ствии имунной типоспецифической сывеличину объема вирусного инокулята. воротки °

Полученная величина обознаЧается Пример. количественное опреКак число бляшкообраэующих единиц деление отдельных типов вируса по(БОЯ/мл) и может быть вйраже- З5 лиОмиелита в живой трехвалейтной вакна в абсолютйых велйчийах или числом цине ° .

10 с соответствующей степенью. Ясли Делают десятикратные разведения необходимо определить содержание ви-.; вакцины.до 10 на растворе эрла или руса в одной прививочной дозе, то по- на среде с 0,5% гидролизата лакталь.лученное значение делится на количе- 4() бумина. Флаконы с семидневной куль ство" доэ в 1 мл исследуеМого-МатЕРИ- турой Почек ЗЕленых мартыаек заража-. ала . . . .- - -- " -." -. ют по 0,1 мл как описано выше, и залйвают питательно-покровным агаром

Данный опыт сопровождается следую- " в который добавляют смеси имунных ти"" щими контроНями"." : " " . " " " " 45 поспецйфических сывороток. Для: опре«

Контроль на чувствительность кухн - .. деленная тйтра вируса Х типа в трех ть ры гКанм к вирусу . Три флакона той вапентной вакцине (флаконЫ 1, 2, 3) . же" йартии"культур ткани, что и"дйя " . i-питательно-покровный агар добавляосиовного-опыта, заражают стандарт-, .-".:ют смесь сывороток II u III типов; ными" вирусными штаммами тех же "типов, для определения титра вируса II .типа . что в исследуемой Вакцине:. Титры этих (флаконы 4, 5; 6) — смесь сывороток штаммов устанавливают заранее riyieM . . Х и.ХХТ тийов и для определения тит многократного титрования и вЪЙедения:. Ра вируса"III типа (флаконы 7, 8, 9)средйего значения тйтра. количество . смесь сывороток II u I типов. Опыт бляшек,, образуюшихся в ЕтИх флаКОнаХ, .;сОПрОвсжДаетея всеми необходимыми не должно отклоняться от заранее ус- 55 контрольными испытаниями, описаннытановленного среднего титра более . ми эймсе. Через 5 дней инкубации за чем в 2 раза.: . -" ..- : : Раженных и контрольных культур про- .

Койтроль кулЬтуры ткани на отсУт- воДЯт поДсчет бляШек в Каждом фластвие бляшкообразующих вирусов- кон- . коне и высчитывают титры вирусов. таминатов. Два незараженных флакбйа 60 Предлагаемый способ обеспечивает от той Ге партйи культуры ткани за- .: " высокую чувствйтельность и точность ливают питательно-покровнйм агаром, : определения.

B который не добавляют имунную типо - Формула изобретения специфическую сыворотку (или смесь Способ количественного определесывороток) . - 65 ййй" вйруса в"вирусных смесях, вклю-, 704986

Составитель С. Малютина

Техред ц.Бабурка Корректор О, Ковинская

Редактор A. Бер

Тираж 526 Подписйое

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делая изобретений и открытий

Заказ 7965/29

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 чающий заражение культуры ткани, инкубирование ее с последукшим нанесением питательно-покровного агара и определением концентрации вируса по количеству бляшек, о т л и ч аю .шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и точ. ности определения, культуру ткани заражают вирусной смесью и после инк убирования наносят питатель но-покровный агар, содержащий антисыворотки ко всем вирусам, кроме искомого.

Источники информации, 5 принятые во внимание при экспертизе

1. Руководство по иммунологии. .Под ред. Вязова О. Е. М., Иедицина, 1973, с. 281.