706026 - Способ выращивания микроорганизмов

Способ выращивания микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Всесоюзная

0 B и-С е=йчй

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (6)) Дополнительный к патенту

/ (22) Заявлено 041275 {21) 2197553/28-13 (И) М. Кл.

С 12 В 1/08 (23) Приоритет вЂ” (32) 06. 12. 74 (3!) 530422 (33) ддА

Государственный комитет

СС CP по делам изобретений и открытий

Опубликовано 25.12.795юллетень,% 47 (5З) УДК 66 3.11 (088.8),Дата опубликования описания 28.12.79 (72) Авто ы

ИностранцывЂ”

Дональд Оливер Хитцмэн и Юджин Герман Вегнер изобретейия (QIIA) Иностранная фирма Филлипс Петролеум Компани (СЩА) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к способам выращивания микроорганизмов, преимущественно бактерий и дрожжей, на питатеяьной среде, содержащей спирт, как основной источник углерода.

Современная нехватка продовольст вия во всем мире вынуждает исследовать и разрабатывать методы производства высококачественйых недорогостоя щих,белков, продуцируемых микроорганизмами, например белков, продуцируе- мых одноклеточными организмами, чтобы таким образом разрешить возникшую проблему. В таких процессах ферментации большое значение имеют разра.ботки по использованию углеводородов и других углеродосодержащих веществ, которые обычно сжигают или иным образом устраняют при очистке нефти.

В качестве основного источника углерода особенно привлекает использование метанола. Метанол смешивается с водой и может быть получен иэ разнообразных углеводородных веществ легко и без больших затрат в любой части мира, где имеется любая форма инфузорной земли. Кроме того, метанол характеризуется отсутствием потенциально" канцерогенных полицикличных углеводородов и т. д.

1 У Известен способ выращивания микро- организмов в условиях аэрации кислородосодержащим газом питательной среды, содержащей прямоцепочные алифатические спирты с 1-1б атомами углерода в молекуле в качестве, источника углерода, источник азота и необходимые минеральные соли (11.

Целью изобретения является интенсификация процесса.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе выращивания микроорга-. низмов аэрирование среды осуществляют так, что в процессе ферментации питательную среду с микроорганизмами поддерживают в виде пены с циркуляцией ее в процессе ферментации.

Изобретение можно рассматривать как процесс аэробной ферментации источника углерода, который усваивается микроорганизмами в ферментерах, заполненных пеной. Источником углерода является спирт, который усваивается соответствующим MHKpoopI ÂíèýìÎì для продуцирования микробиальных клеток, которые можно использовать в качестве источннка пищи (белки, образующиеся в одноклеточных организмах).

Обнаружено, что ферментация в фермен-. терах, заполненных пеной, в случае

)ОбО2б

Соответствующие микроорганизмы можно выбрать из бактерий, дрожжей и грибков. Можно использовать дрожжи видов Candida, Hansenufa, Torus,opsis, Saccaharomyces, Pichia,. Debaryomyces

Lipomyces, Cryptococcus, Nematospora и Brettanomyces., Предйочтительнее использовать дрож жи разновидностей Candida, HansenuKa.

:Torulopsis, Pichia,и Saccharomuces.

Кроме того1 используются виды дрржжей:

Candida boidinii

Candida mycoderma

Candida utiRis

Candida stettatoidea

CandiPa robusta

Candida сáaussenii

Candida rugosa

Brettanomyces petrophiEium

50 (Hangenuta minuta Han5enufa saturnus

HansenuKa ca6ifornica

Hansenuta mrakii

Напвегийа яЫ чз.соГ а

HansenuKa potymorpha

HansenuKa wickerhamii

HansenuEa capsuBata

Hansenufa ц6исозува

Hansenu6a heniic1i

Hansenufa nonfermentans

Hansenut, phi6odenclra

55 непрерывного процесса высоко эффективна. Содержание пены в ферментере можно описать как дисперсию газообразной фазы в жидкой фазе, как эмульгированную газообразную фазу или ripoсть, как эмульсию газовой или жидкой фазы, где увеличенная поверхность между газовой и жидкой фазами усиливает процесс ферментапии, Способ осуществляют следующим образом.,. l 0

Процесс ферментации проводят на пи- тательной среде, содержащей алифати ческие спирты с прямой цепочкой, имеющие от 1 до 1б атомов углерода на молекулу, которые обеспечивают углерод и энергию для роста микроорганиз мов. Спирт имеет от 1 до б атомов углерода на молекулу, предпочтительно использовать этанол или метанол и более предпочтительно вЂ” метанол.

В качестве спиртов используют метанол, этанол, 1-пропанол, 1-бутанол, 1-октанол, 1-додеканол, 1-гексадеканол, 2-пропанол, 2-бутанол и 2-гекса:нол. При необходимости можно также использовать смеси этих спиртов.

В процессе ферментации микроорганизмы способны усваивать один или бо,лее указаннйх спиртов в качестве ис:точника углерода и энергии при их росте или развитии. 30

candida

bo6mii

yersatitis

g6abrata

mo Eishiana

nemodendra

nitratophiOa

pinus

Pichia

P1ñп1а

Pichia

farinosa

po6ymorpha

membranaefàс1епs

pinus

pastoris

tieha6ophifia

Saccharomyces

Saccharomyces Saccharomyces

Saccharomyceв ,Saccharomyces

Используются бактерии вида Вас16Ьв, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Pseudomonas, Nethanomonas, Ргогат1по-bacter, NethyCococcus, Brevibacterium;,, ,Acetobacter, Micrococcus, Rhodopseudo, :monas, Corynebacterium, Rhodopseudo ,1попав, Microbacterium, Achromobacter.

Methy6obacter, Nethy6osinus и Methy-

6ocystis., Предпочтительнее испольэование7

1 бактерий разновидности Baciffus

Рвeudomonas, Protaminobacter, ЮСгоcoccus, Arthrobacter u Corynebaeteг1цщ °

Используются виды бактерий:

Вас1Иив subtiC us

Baci Иив cereus

BacitEus hureus

Вас1Ицв acidi

Вас1 Иив urici

Baci Иив coaguCans

Baci Ипв mycoides

Baci Ыив circu6ans

Baci Nus megaterium

Вас1 86us Cichen1йогп 1в веЫайо Иса

ИдивСг1 огч1Иа

methanica

Ииогеясепв

aeruginosa

o6eovorans

putida

boreopo 6 is руосуапеа

methyfph16цв

brevis ас1йочогапя

methanoFoxidàп:;

aегоgenes

Pseudomonas

Pseudomonàâ

Pseudomonas

ToruCopsis

Toru Cops is

Toru6opsis

Тогиборв1в

Torufopsis

Torulopsis

Toru6opsis

ToI uJopsis

cerevisiae .

fragitis

rosei

acidifaciens

eKegans

r aux ii

Вас 11в йractum .

706026

Rhizopus

nigricans

oryzae

de femar

arrhizus

stofonifer з1щрбех

hydrocarbooxydans а5kanum обеорЬ16иs

hydrocarbochastus

g6utamicum

viscosus

dioxydans а Юсапию

Corynebacterium

Corynebac ter 1um

Corrynebacterium

Corynebacterium

Mucor mucedo

Mucor genevensis.

grchromobacter соадпбапз Щ

Brevibacterium butanicum

Brevibacterium roseum

Вгеч1Ьас1ег1шп f6avum

Brevibacterium 6actofermentum

Brevibacterium рагайЕ1псбуЫсшп

Brevibacterium ketogCutamicum

8rеч1Ьасterium insectiphЮium;

Применяются грибки иэ рода AspergiK-:

Сиз, Moni6iа, Rhizopus, Реп1с1К1шп, Nucor, Afternaria u HeCminthosporium. 5О

Реп1с1663лвп

Penici 66iuni

Реп1с1И1ив

Penici 66ium

Реп1с1 6Ыпт

Penici И1шп

Реп1с1 И ium

notatum

chrysogenum

g Gaucum

griseofuEvum

expansum

digitatum

ita Kicum

Protaminobacter ruber

Micrococcus cerificans

Nicrococcus rhodlus, Arthrobacter rufescens

Arthrobacter parafficum

Arthrobacter simplex

Arthrobacter citreus

Nethanomonas methanica

Methanomonas methanooxidans

Nethy6omonas . agiKe

ИеЮЬуВоюопаз a6bus

Nethyfomon s rubrum

Methyfomonas methano6ica

Nycobacter1шп rhodochrous

Mycobacterium ph1е1

Mycobacterium brevicaFe

Nocardia safmonico8or

Nocardia minimus

Nocardia cora 661na

Nocard1a butanica

Rhodopseudomonas capsuKatus

Midrobacterium ammoniaphi6um .

Примеры используемых видов грибков;

AspergiELus niger

Азрещ168из @Caucus;

ASpergi 66из clavus

Aspergi66us terreus

Aspergi28us itconicus

На рост микроорганизмов оказывает влияние температура ферментера и каждый отдельный вид микроорганизма имеет оптимальную температуру для роста. Выращивание в::фермейтере проводят при 30 и 65 С, предпочтительно между 35 и 60 С. Температура зависит от используемых в процессе ферментации видов микроорганизмов, так как они будут иметь некоторое различие в соотношении температура/скорость роста.

Соответствующую питательную среду подают в ферментер для обеспечений питательных веществ, таких как усваиваемый источник азота, фосфора, маг« ния, кальция, калия, серы и натрия, $ !так же. как следй меди, марганца, молибдена, цинка, железа, бора, иода и ! селена, при этом количество питательных веществ изменяют в зависимости ! от выбранного ля, процесса вида мик- роорганизма. Питательная среда может также содержать. витамины, присутствие которых желательно для -развития определенных видов микроорганизмов. Мно;гие иэ дрожжей требуют наличия одного или двух витаминов, например биотин и тиамин.

Состав питательной срещя на 1 л водного раствора:

Н РО4(85%)

2 0 мл

КСС l,0 r

MgSO4. 7Н О 1,5 г

СаСЕ2 ° 2Н О 0,2 г

ЫаСЕ 0,1 r

Раствор неорганическйх соединений вЂ” 5,0 мл .

Раствор неорганических соединений в ниде следов имеет следующий состав, г/л:

CuSG4 ° 5Н20 : -0,06

К6 0,08

ГеСВ 6Н20 4,80

МпБО4 Н О 0,30

Na Mo04 2Н О 0,20

2пБ04 7Н О

2,00

НЬВОЬ 0 02.

При использовании проведенной питательной среды источник усваиваемо го азота обеспечивают раздельным добавлением водного раствора аммиака (ИН40Н) в ферментер. Количество добавки NH40H зависит от рН требуемого для данной реакционной смеси, которое беэ добавления NH

5 дрожжей или грибков рН равно, пример70б026 но, 3-5, а при использовании бактерий рН равно б-7,5.

Ферментация представляет собой аэробный процесс, в котором кислород, необходимый для йроцесса, получают из источника, содержащего кислород, 5 например из воздуха, который подают в емкость для ферментации при давлении, приблизительно от 1 до 100 атм. и, предйочтительно,от 1 до 10 атм.

Хорошим источником кислорода является воздух, обогащенный кислородом.

На реакцйю ферментации часто благоприятно действует применение давления в вЫшеуказанной области и в предпочтительных пределах.

Ферментацию проводят непрерывно или периодически. В непрерывном или периодическом процессе ферментер вначале стерилизуют, а затем его засевают -культурой микроорганизма при наличии всех необходимых питательных веществ, включая кислород и источник углерода. При непрерывном процессе источнйк кислорода или воздух подают непрерывно вместе с непрерывным вводом питательной среды, источника азо- 25 та (если он добавляется отдельно) и спйрта с расходом, который или предварительно задают, или задают в соответствии с требованием регулирования таких параметров, как концентрация 30 спйрта, степень растворения кислоро да; концентрация кислорода или двуокиси углерода. в газах, выходящих из ферментера. Скорость подачи различных веществ изменяют так, чтобы . В5 при эффективйом использовании спирта получить как быстрый рост микроорганизмов, так и возможную консистенцию, т. е. высокий весовой выход микроорганизмов на вес загРужаемого спиРта. 40

Скорость подачи спирта является важ ной переменной величиной, подлежащей регулированию, так как высокая кон-

" центрация спирта может фактически затормозить рост микроорганизмов и 45 даже убить микроорганизм, поэтому ее регулируют так, чтобы спирт микроор-. ганизмы потребляли с той же скоростью, с какой спирт поступает в ферментер.

Удовлетворительные условия достигают, если в выходящем потоке будет содержаться около 0,5 об.% спирта. Для высокой продъктйвности или скорости рост микроорганизмов концентрация спирта, поступающего к ферментеру, будет Составлять, примерно, от 7 до

30 об,Ъ. Для периодического или непрерывно-го процесса концентрация вещества, идущего на переработку, например метанола, должна находиться между 60

0,001 и 5 об.% .и, предпочтительно, между 0,005 и 0 5 об.В. В другом случае при периодическом процессе ферментации питание можно добавлять порциями и постепенно.

В процессе ферментации используют контрольно-измерительную аппаратуру для Рэмерения плотности микроорганизмов, РН, концентрации растворенного кислорода и спирта на входе и выходе из ферментера, обеспечивая тем самым полную систему управления процессом.

Продукты, подаваеьые в ферментер, обычно стерилизуют дт1я предотвращения заражения смеси в ферментере нежелательными жизнеспособными микроорганизмами. Удаляемый из ферментера поток надлежащим образом обрабатывают для сепарации микроорганизмов, содержащих белок,. образующийся в одноклеточных организмах, например, с помощью тепла и/или химических реагентов, например кислоты для умерщвления микробиальных клеток и их отделения от водной, фазы посредством коагуляции или флоккуляции. После такой обработки смесь центрифугируют для удаления большей части жидкой фазы, и затем отделенные клетки сушат в барабанных или распылительных сушилках.

Если в качестве культуры применяют дрожжи, вышеуказанные стадии обработкй могут быть йзменены". вначале про-. водят центрифугирование для сепарации клеток, которые.затем умерщвляют: под действием теплоты до или во вре-. мя последующей стадии сушки. После ,сепарации и сушки клетки, содержащие большое количество белка, готовы для использования в качестве источника питания для животных и/или людей .

П р и м e p 1. Проводят три опыта, в качестве источника углерода и энергии используют метанол, который вводят в ферментер известного типа в условиям пенообразования. Объем ферментера составляет, примерно, 1500 л.:

В каждом опыте температуру поддержи,вают при 39"С и рН вЂ” б,б. На выходе из ферментера отсутствует метанол, концентрация которого составляет lO o6.%. Питательной средой служит среда, описанная выше, Используемые в каждом из этих опытов микроорганизмю представляют собой виды бактерий

Pseudomonas methan1ca под номером

NRRL В3449. Данные, представленные в табл. 1,получены после того, как каждый опыт достигает стадии готовности, примерно, через 12 час непрерывйой работы. Процесс идет при 3-х различных давлениях, 706026

Таблица 1

Опыт

1,97

810

2,6

750

164

68,5 (при давлении на входе в 2,75 атм) 125 (при давлении на входе в 2 атм) 15

270

235

145

0,8

22,7 (клетки, изолиров а нные фильтрацией пробы через фильтр Ииллипор) 940

950

1110

0,36

2,8

0,29

3,44

2,5

2,3

О, 175

5,7

3,3

3,6 1,5

3,3

3,21

2,58

75 3,48

8,8

8,9

4,0

Условия ферментации

Давление, атм

Загрузка ферментера, кг

Поток воздуха, м /час

Растворенный О> в ферментере в пересчете на содержание О без присутствия клеток, Ф

Уровень б в выходящем воздухе, в пересчете на нормальный О, содержащийся в - воздухе, %

Скорость подачи среды 1/час

Скорость подачи ИН4ОН,приблизительное значение Потребления NH40H (25 вес.Ъ NH>), л/час Вес сухих клеток, г/л

Обороты маыалки, мин

Расчетные величины

Скорость раз в еде ния, час

Время пребывания, час

Норма аэрации об/об, мин

Т1отребляеьый О, кг/кг клеток

Выход клеток, кг

СН ОН в пересчете на потребляемый метанол, кг

Неочищенный белок (Ык. 625), Ф

Продуктивность r. клеток, л/час

Результаты этих опытов показйвают повышенную продуктивность непре ь вной ферментации при наполнении ферментера пеной и массопереносе кислорода около 1000 ммол О на л/час жидкой смеси.

2,3 4

30,6 24,6 (клетки, (клетки,изоизолиро- лированные ванные фильтрацией центрифу-пробы через гировани-фильтр Милем 10 м 3 липор) пробы промывка клеток, повторное центрнфугирование, сушка, взвещивание) Контрольный пример.

Опыт, являющийся контрольным по непрерывной ферментации,также выполняют с использованием той же бактериальйой культуры, пйтательнсй среды и концентрации метанола, как в приме12

706026

Пр имер 2. В опытах 4,5 {см табл. 2) по непрерывной ферментации с метанолом используют ферментер, наполненный пеной, применявшийся в примере 1, и ту же питательную среду, но с культурой дрожжей.

В этих опытах используют 10%-ную концентрацию метанола, на выходе из ферментера в потоке метанол не обнаруживают. Каждый опыт проводят при атмосферном давлении.

Во время .проведения опыта 4 устанавливают, что ферментирующая смесь загрязнена филаментныйи грибками, по этому перед проведением опыта 5 систему реактора стерилизуют. Данные опытов 4 и 5 представлены в табл . 2, которые рассматриваются как типичные "для процесса непрерйвной ферментации метанола при указанных условиЧЩ °

Та блица 2

Услови я ф

Загрузка ферментера, кr

Температура, С

Поток воздуха, м /час

Раствореннйй 0 в ферментере при давлении на входе в 2 атм, В

725

800

101

121 !, Пр и давле нии на вхо.де в 2,75 атм

Уровень О s выходящем воздухе, Ф > при давлейии на входе в 2,75 атм рн

Скорость загрузки среды, 1/час

Скорость подачи NH ОН в пересчете на содержание О без присутствия клеток, л/час

Вес сухих клеток, г/л

Обороты мешалки i минуту

3,5

3,6

1000

980

Расчетные величины

Скорость разведения, час 0,12

8,4

2 8 .

3,4 0 14

7,2

2/1

Время пребывания, час

Норма аэрации, об/об/мин,, Потребляемый О, кг/кг клеток

Вы1сод клеток, кг СКЛОН в пересчете на нормальный О, содержащийся в воздухе, клеток

3,04

3,29

Неочищенный белок, приблизительное значение потребления NH4OH (253 по весу ЯН ) %

Продуктивность, г/л/час

3,6

2,9 ре 1. Температуру поддерживают 40 C и рН вЂ” 6,3, близкие к величинам опытов примера 1. Этот опыт проводят в большей емкости обычного типа, снабженной лопастной мешалкой, так как емкость для ферментации работает при 5 атмосферном давлении. Объем ферментйрующей смеси равен, примерно, 1125 л.

В выходящем из ферментера потоке метанол не обнаруживают, Полученный вес сухих клеток равен 19, 1 г/л. 10

Результаты подсчета для этого опыта -следующие.

Норма разведения, час 0,12

Время пребывания, час 8,3

Выход,кг СН ОН/кг клеток . 4,0

Неочищенный белок, % 75 Продуктивность, г/л/час 2,3.

Результаты этого опыта хуже резуль-; татов опыта 1 в примере 1, где использчют ферментер с пеной.

706026

Формула изобретения

Составитель A. Бражникова

Редактор Е. Гончар Танкред Л.Алферова Корректор Е.Лукач

Заказ 8075/66 Тираж 526 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д; 4/5

Фи и«п ППП 11атент, r. Ужгород, ул. Проектная, Эти результаты демонстрируют ис= пользование дрожжей для непрерывной ферментации метанола в ферментере, заполненном пеной, для производства белка одноклеточнйми организмами.

Так как дрожжи обладают присущей 5 им более низкой скоростью роста, чем бактерии, производительность, показанная s табл. 2, ниже производительности, полученной при использовании бактерий. 10

Белки одноклеточных организмов, полученные предлагаемым спссобом, приобретают особенно важное значение.

Б последиие годы таких источников большого количества недорогостоящих белков, годных для употребления животными и людьми, как рыбная мука и соевые боби, не хватает в связи с ростом народонаселения, Кроме того, происходит уменьшение производства рыбной муки, зависящего от улова анчо- 2О усов.

Получение белков одноклеточных организмов (ЗСР) может облегчить . проблему посредством обеспечения источника белка, который можно Ъклю- 25 чить в пищу домашней птицы, свиней и рогатого скота, что обеспечивает белками людей. Микробиальные клетки, полученные предлагаемым способом, являются подходящим источником белков и могут, таким образом, использоваться в качестве пищи,,а также, применены в других областях, например, для производства белковых клее, вых составов.

Способ виращивания микроорганизмов, преимущественно бактерий и дрожжей, в условиях аэрации кислородсодержащим газом питательной среды, содержащей прямоцепочные алифатические спирты с 1-16 атомами углерода в молекуле в качестве источника углерода, источник.азота и необходимые минеральные соли, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью интенсификации процесса, аэрирование среды осуществляют так, что в процессе ферментации питательную среду с микроорганизмами поддерживают в виде пены с циркуляцией ее в процессе Ферментации.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США Р 3.677895, кл. С 12 D 13/06, опублик. 1972.

Способ выращивания микроорганизмов

Патент 706026