Способ количественного определения активности хлорамфениколоксидоредуктазы у микроорганизмов
Патент 706444
Авторы
Классы МПК
Способ количественного определения активности хлорамфениколоксидоредуктазы у микроорганизмов
Иллюстрации
Реферат
Союз Советскии
Социалистическик
Республик пц 706444
К АВТОРСКОМУ СВйдЕТЕДЬСТВУ ..:. (61) Дополнительное к ввт. свид-ву (22) Заявлено 100478 (21) 2601988/28-13 (51) А . Кл.
С 1. К 1/00 с присоединением заявки ¹â€”
Государственный комитет
СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет
Опубликовано 30.12,79. Бюллетень ¹ 48 (53) УДК 576. 8. 09 3., 1 (0 88. 8) Дата опубликования описания 30.1279 (72) Авторы изобретения н.В. коробейник, Б.н. мишанькин и л.A. Абрамова (71) Заявитель
Ф
Ростовский-на-Дону государственный научноисследовательский противочумный институт (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
АКТИВНОСТИ Х310РАМФЕНИКОЛОКСЙДОРЕДУКТАЭЫ
У МИКРООРГАНИЗМОВ
Изобретение относится к области медицины, а именно микробиологии.
Известен способ количественного определения активности хлорамфенйколоксидоредуктазы у микроорганизмов путем выращивания их в питательной среде с последующим суспендированием, инкубированием, осаждением белка из микроорганизмов и опрЕделением активности фермента по количеству восстановленного в реакции диазотирования р-аминохлорамфеникола, Однако известный способ является длительным.
Целью изобретения является ускоре-15 ние способа.
Эта цель достигается тем, что
I суспендирование проводят в манннт-минеральной среде на трио-НСс -буфере при рн 7 †. 8 и инкубируют в анаэроб- 20 ных условиях в присутствии источника электронов НАДИ или НАДФН
Пример 1. Клетки чумного микроба выращивают в течение 48 ч на .агаре Хоттингера (рН 7,1) при 28 С.
Собранную бактериальную массу пере» носят в маннит-минеральную среду, приготовленную на 0,02М трис-HCt -буфере (рН 7,8) следующего состава,в г/л.: маннит 5,0у MgSO4 0,25;(NH4.) 804 1,0;ЗО
Ма ВО 1,0; DL — метионин, DL. — тре онйн и DL - P-фенил-А-алании по 0,04;
L — цистеин 0,1. Инкубационная смесь содержит открытые клетки (5 мг сухой биомассы в 1 мл), хлорамфеникол
3,0 мкМ/мл, НАДНg йли НАДФН<40 ??????>
0,2 м 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. ОбраэовавЫййся осадок отделяй1т цейтрифугйрованием (4000/ 5 Мин), и в надбсадочной жидкости определяют содержание первичного ароматического амина. Иэ надосадочной жидкости отбирают 1,0 мл, приливают по 2,0 мл 0,25 н. НСВ и по каплям 1,0 мл 0,1% НаИО до появления избытка HNOg Вследствие неустойчивости солей диазония, легко диссоциирующих на катйон диазония и аннов галогена, диазотирование проводят в охлажденной бане со льдом, = 0 — 5 С. В процессе диаэотирования реакционная смесь должна иметь
° 4 в ф р/ ФФ;7Ф ., М 4 ф У °, : а ф, .
3 . .; .706444„ .. 4 сильнокислую реакцию. Пробы тщатель- материала. Инкубационная смесь в но перемешивают на холоду в течение объеме 2 мл содержит бесклеточный
10 мин, после чего раствор должен . экстракт (6 мг белка), хлорамфенидавать отчетливую положительную реак- кол 3 мкМ/мл, НАДН < или НАДФН цию на иодкрахмальной бумаге. 40 мкМ/мл и маннитминеральную синтеизбыток ннОз, в пробах устраняют 5 тическую среду, приготовленную на добавлением 0,4 мл 10%.-ной мочевины 0,02М трис — HCE-буфере (рН 7,8) . и спустя 10-15 мин завершение реак- Контролями служат пробы без источ цйи также регистрируют с помощью ника фермента (экстракта) и без субиодкрахмальной бумаги. Далее к про- . страта (хлорамфеникола) .Остальные. бам добавляют,0,5 мл 0,3%-ного р-ра 0 этапы общие с приведенными в примеа(-.нафтиламина, который готовят на ре 1, смеси 20 мп уйсусной кислоты и
80 мп н О. Аэосочетание проводят в за единицу активности фермента приизбЫтке oL -нафтиламйна в течейие йймают такое его количество, которое часа при охлаждении до 0-10 С. катализирует образование 1 нмоля рИсследуеМый раствор должен иметь аминоХлорамфеникола в 1 ч при данных
15: рН 4,0-4,5 (индикатор бромфеноловый условиях опыта. Удельную активность синий), который доводят с помощью су- хлорамфениколоксиредуктазы выражают мого ЯаНСО или 1 í. NaOH;" Прирост в единицах на 1 мг белка. Использооптической плотности в опытной про- вание изобретения позволяет ускорить бе измеряют на спектрофотометре 20 расшифровку- механизмов хромосомной (СФ-16) при 520 нм против пробы, со- и плазмидной устойчивости к хлорамдержащей толькб реактивы. Колнчест- фениколу у возбудителей чумы и холеры. во "ароматического амина хлорамфени-кола. расчитывают rio калибровочному графйку; "используя в качестве стан- 25 Формула изобретения дарта р-аминобензойную кислоту или любой другой коммерческий ариламин. Способ количественного определения Образованию 0,02 .мк пбля ариламина активности хлорамфениколоксидоредуктасбответствует йзменение оптичeckoA зы у микроорганизмов путем выращивания
fL1ICJTAocTH на 0,150. 30 их в питательной среде с последующим
Пример 2. Клетки чумного суспендированием, инкубированием, микроба выращивайт на агаре Хоттин- осаждением белка из микроорганизмов и гера (рН 7,1) в течение 48 ч при определением активности фермента по
28 С; Бактерийльную массу отмывают количеству восстановленного в реак от питательной средй 0,85%-нйм раст- g5 ции диазотирования р-аминохлорамфенивором хлористдго натрия, растирают кола, отличающийся тем, с кварцевым песком, экстрагируют что, с целью ускорения способа, 0,02 Й трис HCC — буфером (pH 7,8) суспендирование проводят в маннит- ..
:. в течение 12 ч при 40C. Экстракты, минеральной среде на трис-HCE -буфейолу4енййе после часового центрифу- 4 ре при рН 7-8 и инкубируют в анагирования при 15000ф на холоду, эробных условиях в присутствии истоЧ"используйт в качестве ферментного ника электронов HAgH или НАДФН
Редактор Г. Прусова
Заказ 8163/22
Составитель Е. Дубовицкая
Техред И.Асталош Коллектор О. Ковинская
Тираж 526 Подписное
ЦНИИПИ РоСударственйого комитета СССР по делам изобретейий и открытий
113035 Москва, Ж-35< Раушская наб. д. 4/5
Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная,4