Способ получения иммобилизованных холинэстераз

Способ получения иммобилизованных холинэстераз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

па,тентне телк, ческал! 0 и и с х"н Й-е

Colo3 Советскик

С щиалистичесиих

Реснублик (61) Дополнительное к ант. санд-ау— (22) 36ll1llено 270977 (2t) 25?6977/23-04 с пр единением заявки И2— (23) Приоритет—

Опубликовано 05.01.80. Бюллетень Н91

Дата опубликования описания 05.01.80

<51)М. Кл.2

С 07 С 7/02 П

A 61 К . 37/48

Государственны Я комнтет

СССР по делам нзобретеннй н открытнй (Я) УД (577 ° 15 °.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

М.Э.ХаГа, А;Э.Лаэне, Э.В.Пеэнема и А.А.Аавиксаар (71) Заявитель

Институт кибернетики Академии Наук Эстонской ССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

ХОЛИНЭСТЕРАЗ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и в частности, к способу получения иммобилиэованных холинэстераз, который может быть применен для изготовления высоко-5 чувствительных анализаторов для определения отравляющих веществ антихолинэстеразного действия. Такие анализаторы могут быть применены в сельском хозяйстве для определения инсектицидов.

В литературе описан ряд способов получения иммобилизированных на неорганических материалах ферментов, в том числе холинэстераз, включающих . 15 обработку неорганического материала . -аминопропилтриэтоксисиланом с последующим переводом аминогрупп в такие функциональные группы, которые способны реагировать с функцио- 20 нальными группами молекул ферментов (ll, f2l .

Недостатком этих способов иммобилизации ферментов является многостадийность процесса получения активных 25 реакционноспособных групп на поверхности неорганического материала.

Известен также -способ получения иммобилизованных холинэстераз на не органическом носителе, включающий 30 активирование неорганического носителя и последующее ковалентное связывание с ним фермента (3). Согласно известному способу, пористое стекло обрабатывают раствором г-аминопропилтриэтоксисилана в толуоле. Далее аминопроизводное стекла связывают с и-нитробензойной кислотой, полученный нитробензамид восстанавливают и диазотируют. Приводят связывание ацетипхолинзстеразы с полученным активированным носителем. При этом выход по BK THBHocTH составляет О, 5 %

Полученные препараты иммобилизованной холин эстера зы являются нестаб иль ными и в течение 10 дней активность иммобилизованного фермента уменьшается в 3 раза. Таким образом, недостатками известного способа иммобилизации холинэкстераз являются многостадийность активирования носителя,. малый выход ферментативной активности при иммобилизации и нестабильность полученных препаратов.

Целью описываемого способа является устранение недостатков известного способа, а именно, упрощение способа иммобилизации, увеличение выхода ферментативной активности и по вышение стабильности иммобилизован707923 таблица рН раствора связывания

7,2 7,6 8,1 8,3 8,6 9,0

Содержание активной бутирилхолинэстеразы на 1 г окиси алюминия, мг

2,6 5,4 106 10,9 9,0 6,4 ных холинэстераз. Укаэанная цель достигается за счет того, что неорганический материал .активируют раст.вором хлористого цианура в органическом растворителе и, после .связывания фермента препараты обрабаты1вают водным раствором .гидроксиламина.

Согласно изобретению описывается упрощенный способ получения иммобилизованных холинэстераэ на неорганических носителях, включающий активи-, рование неорганического материала и ковалентное связывание фермента, с высоким выходом ферментативной активности и повышенной стабильностью иммобилизованных холинэстераэ, заключающийся в том, что неорганический носитель активируют раствором хлористого цианура в органическом растворителе и, после связывания фермента, препараты стабилизируют водным раствором гидроксиламина. 20

Предпочтительно процесс проводить следующим образом.

Активирование неорганического материала (силикагель, пористое стекло, окись алюминия) проводят путем обработки названных материалов 1-.5Ъ раствором хлористого цианура в диоксане„ ацетоне, хлороформе, или диэтиловом эфире в течение 2-3 ч при комнатной температуре. Количество прореагировавшего с неорганическим материалом хлористого цианура не зависит существенно от растворителя.

Обработанный хлористым циануром материал промывают ацетоном, 10-30Ъ

:раствором уксусной кислоты и водой °

Полученный препарат высушивают на ротационном испарителе.

Связывание холинэстераз проводят из раствора фермента в буфере. В случае силикатных носителей (силика- 40 гель, пористое стекло) максимальный выход ферментативной активности наблюдается при рН связывания 4,5-6,5, а в случае окиси алюминия — при рй

8,0-8,5. Продолжительность стадии 45

П р и м e p 3. Силикагель марки

Силохром-2, активированный по при еру 1, содержит 2,8 мкмоля хлорисТого цианура на 1 r носителя. Связысвязывания при комнатной температуре составляет 6-48 ч.

Полученные препараты дважды промывают буфером связывания и обрабатывают 0,2 М раствором гидроксиламина при рН 8,0-9,0 в течение 2-6 ч . Благодаря этой обработке удаляют непрореагировавшие атомы хлора и существенно повышается стабильность полученных иммобилизованных холинэстераэ.

Полученные препараты многократно промывают 1,0 М раствором хлористого натрия и хранят в холодильнике во влажном состоянии.

Пример 1. Навеску окиси алюминия (5,0 г) суспендируют в 20 мл

5Ъ раствора хлористого цианура в диоксан. Через 3 ч избыток раствора дикантируют, препарат промывают дважды диоксаном, дважды 20Ъ раствором уксусной кислоты, многократно водой и три раза ацетоном. Полученный препарат высушивают на ротационном испарителе.

Количество прореагировавшего хлористого цианура определяли спектрофотометрически. С 1 граммом окиси алюминия прореагировало 3 мкмоля хлористого цианура.

Пример 2. Навески активированной, как описано в примере 1, окиси алюминия (0,5 r сухого препарата) суспендируют в б-миллилитровых порциях буферных растворов (рН 7,2-9,0), содержащих по 9 мг бутирилхолинэстеразы. Через 24 ч препараты промывают дважды буфером связывания и обрабатывают в течение

3 ч 0,2 М раствором гидроксиламина при рй 8,6 После многократного промывания 1,0 М раствором хлористо- го натрия определяли активность препаратов по скорости гидролиза

4 10 М бромистого бутирилхолина в

0,15 М растворе NaCI в присутствии

4 10 М трис-(оксиметил) аминометана.

Полученные результаты приведены в табл.1.. вание бутирилхолинэстеразы и определение ее ферментативной активности, проводят аналогично примеру 2. Результаты представлены в табл.2.

707 923

Т а б л и ц а 2

4,0 4,5 5,1 5,7 6,0 6,5 6,9 рН раствора .,связывания

Содержание активной бутирилхолинэстеразы на 1 мл силикателя, мг

10,1 13,3 14,5 15,4 14,9 13,5 10 1

Таблица 3

24

100 5 0

Препарат 1

Препарат П

100 107 127 133

Тираж 495

ЦНИИПИ Заказ 8430/21

Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 4. Пористое стекло активируют по примеру 1. 1 г активированного стекла суспендируют в 12 миллилитрах буферного раствора при рН. 6,5, содержащего 18 мл бутирилхо" линэстеразы. Через 20 ч препарат промывают дважды буфером связывания. Одну порцию полученного препарата обрабатывают в течение З.ч

0,2 M раствором гидроксиламина при рН 8,4 (препарат 11) . Вторую порцию не подвергают такой обработке (препарат 1) . Оба препарата промывают многократно 1 0 N раствором хлористого натрия и хранят в холодильнике при 40С во влажном состоянии. Табл.З характеризует сохранение ферментативной активности Во времени 8Ъ от первоначальной.

Время в неделях 0 2 5

Пример 5 ° Навески активированного силикагеля марки Силохром-2 (0,5 r) суспендируют в б мл фосфатного буфера рН 6,0, содержащего

2,0 г пропионилхолинэстеразы или 45 . 3,0 мг ацетилхолинэстеразы из яда кобры. Продолжительность стадии связывания составляла 20 ч. Обработка раствором гидроксиламина и промывание препаратов не отличаются от 50 описанных в примере 2. Активность препаратов определяют по скорости гидролиза иодистого ацетилхолина в 0,15 И растворе хлористого натрия в присутствии 4 ° 10 трис-(оксиметил) аминометана.

Найдено, что 1 г силикагеля содержит 2,3 мг активной пропионилхолинэстеразы или 3,4 мг активной ацетилхолинэстеразы.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованных холинэстераз на неорганических носителях, включающий активирование неорганического носителя и ковалентное связывание фермента, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса, увеличения выхода ферментативной активности и повышение стабильности иммобилизованных холинэстераз, неорганический носитель активируют раствором хлористого цианура в органическом растворителе и после связывания фермента препараты стабилизируют водным раствором гидроксиламина °

2. Способ по п.l, о т л и ч а ю— шийся тем, что, в качестве органического растворителя применяют диок-. сан, ацетон, хлороформ или диэтиловый эфир, а в качестве носителя - пористое стекло, силикагель или окись алюминия.

3. Способ по п,.п. 1,2, о т л и— ч а ю шийся тем, что связывание холинэстераз на активированных порис.том стекле и силикагеле проводят при рН 4,5-6,5, а на активированной окиси алюминия при рН 8,0-8,5.

4 Способ по п,п.1-3, о т л и ч а ю шийся тем, что применяют

0,2 N водный раствор.гидроксиламина и стабилизацию осуществляют при рН

8,0-9,0 в течение 3-6 часов при комнатной температуре.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1 1. Патент США 93669841, кл. С 07 С 7/12, опублик, 1972, 2. Патент Великобритании N1398018, кл. С 07 G 7/02, опублик. 1972.

3. Baum G,, Ward F.B,:., WeetaII Н.Н. Stability inhibition апй reactivation

of acetyIchoIinesterase cava IentIy

counIed to glass "Вiohys.Вioch. Acta"

268, 411, 1972 (прототип) .