Способ выделения и очистки декстраназы

Способ выделения и очистки декстраназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) ДополиитФльиое к двт. саид"ау (22) Залвлеио 270777 (21) 2511445/28-13 с лрисоедииеиием заявки М— (g)) Кл.2

07 G 7/028//

С 12 D .13/10

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет (53) УДК663. 15 (088; 8) Опубликовано 05.0180. Бюллетень М1

Дата опубликования описания 0501.80 (72) Авторы изобретения

Т.И,Данилова, В.И.Максимов и Г.A.Èoëîäîâà (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (54 ) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ДЕКСТРАНАЗЫ

Предлагаемый способ относится к ферментной области микробиологической промышленности, он может быть использован в производстве и очистке ферментов, полученных из микроорганизмов. По этому способу осуществляется выделение и очистка фермента декстраназы при глубинном культивирова« нии микробных продуцентов, в частности, грибов рода PeniciIEium или

Fusarium с использованием приемов солевого осаждения фермента и адсорбции era на алюмосиликатных глинистых минералах.

Минеральные сорбенты широко используют для очистки ферментов .

Известен способ (1), согласно кото:рому декстранаэу сорбируют иэ исходного раствора культуральной жидкости на глине при рН 4,0-5,0 и десорбируют при рН 7-9. Затем добавляют анионит ДЭАЭ-целлюлозы к полученному раствору .фермента,.при этом фермент связывается с анионитом, после чего проводят элюирование фермента с ионита °

В качестве глин-сорбентов, декстраназы применяют каолнн, получая наилучшие результаты, а также фулерову землю, флоридин, бентонит и дру.гие.

Основными недостатками известного способа очистки фермента являются многостадийность-и трудность реализации способа в условиях крупномасштабного производства вследствие использования дорогостоящих анионитов на полисахаридной основе, а также наличия стадии обессоливания раствора фермента после элюирования с ДЭАЭ-целлюлозы. Кроме того, по известному способу не проводится предварительная обработка глины с целью повышения ее адсорбционной способности, нет сведений о степени очистки ферментного препарата от углеводных примесей.

Цель изобретения - повышение степени чистоты фермента, а также упрощение .технологического процесса его получения.

Цель достигается тем, что перед сорбцией фермент осаждают иэ культуральной жидкости сульфатом аммония, полученный осадок растворяют в воде или буфере, а сорбцию ведут при предварительно активированном минеральном сорбенте.

707925

Таблица 1

Фракция, содержащая фермент

Глина обработанная кислотой необработанная прогретая

Активность фермента, глюкоз.ед.

Выход фермента

Активность Выход фермента, фермен глюкоз.ед. та,%

Активность Выход ф рмента, фзрменглюкоз.ед. та, %

Супефнатант после сорбции фермента на глину

8000

24600

26

3200

Элюат (после десорбции) 25400

82

35500

90000

П р и м е ч а н и е. Концентрация аскангеля 1%.

Т а блица 2

Исходная бесклеточная культуральназ жидкость

5 — 6

61000 100

9900

940 65

Раствор, полученный по предлагаеМому способу, после десорбции декстраназы с глины

34500О, 05-0, 1 36070 57-60 77 350-450 14

Для активирования сорбента были испытаны разные способы: 1) обработка 3 объемами концентрированной соляной кислоты в течение 2-3 ч при комнатной температуре с последующей промывкой глины водой и центрифугированием для отделения глины от

Из.табл.1 видно, что без активирования глины выход фермента после десорбции составляет только 51%, при активировании — повышается до 80% ЗО и более.

Ферментные препараты, подвергавшиеся предварительной очистке путем осаждения сульфатом аммония, содержат достаточно высокие концентрации этой З5 соли, отделение которых в лабораторных условиях может быть осуществлено диалиэом или гель-фильтрацией. В про« язводстве эти приемы приводят к значи.

Способ может найти применение при промышленном производстве высокоочищенных ферментов декстраназы медицинского назначения. жидкости; 2) прогрев сухого порошка аскангеля в сушильном шкафу при

200 .С в течение 4-5 ч.

Сравнительные данные о влиянии способа Обработки глины на резуль таты сорбции.и десорбции приведены в табл.1. тельному удорожанию получаемого продукта. Однако оказалось, что присутствие сульфата аммония в растворе

t декстраназы не мешает сорбции этого фермента на глине, что позволило исключить промежуточную стадию обессоливания раствора фермента после его фракционирования сульфатом ам мония.

В табл.2 приведена характеристика эффективности предлагаемого способа очистки декстраназы от примесей.

Пример 1. Посевной материал гриба Реп1с1?11шп йип1си1озит шт,15 выращивают 3 сут. на питательной среде (0,8% декстрана, 0,08% К НРО4, 0,1%

707925

Формула изобретения

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 93627643, кл.195-66, опублик. 1971.

Тираж 495 Подписное

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

NaNOg, 0,06% MgS04, 0,02% КС1, рН

6,0) в колбах емкостью 750 мп на качалке при 30 С. Культуру выращивают на той же среде в колбах емкостью

750 мл (no 300 мп культуры в колбе) в течение 4 сут. Биомассу отделяют центрифугированием, а бесклеточную культуральную жидкость при рН .4,4 (подкисление проводят концентрированной уксусной кислотой) упаривают в 10 раз в колбе емкостью 10 л при наружной температуре 40 С. Из 10 л культуральной жидкости получают

1 л концентрата. К этому раствору добавляют 460 г сульфата аммония (в расчете 70% от полного насыщения).

Оставляют на ночь в холодильнике.

Осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин и растворяют в 200 мл воды. Нерастворившуюся часть отделяют центрифугированием, а раствор, содержащий 2О декстраназу, подкисляют до рН 4,5 концентрированной уксусной кислотой.

К этому раствору прибавляют аскангель в количестве 2% по сухому весу глины.

Аскангель предварительно активиру- 25 ют ° С этой целью глину заливают концентрированной соляной кислотой из расчета 1:3 (вес:объем) и оставляют при комнатной температуре в течение 2,5 ч, периодически переме- ЗО шивая всю смесь. После отстаивания смеси и осаждения глины кислоту сливают, а глину отмывают дистиллированной водой до рН 5,0.

Для сорбции декстраназы на активированноь аскангеле раствор фермента перемешивают на магнитной мешалке в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Глину с адсорбированном на ней ферментом отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем глину промывают 250 мп 0,01 М ацетатного буфера рН 4,4 и повторно отделяют центрифугированием.

Для десорбции фермента с аскан- 45 геля добавляют 75 мл 0,05 И трис-НС1 буфера рН 8,6 при постоянном перемешивании в течение 0 5 ч, глину отделяют центрифугированием и повторно обрабатывают 35 мп того же буфера. >

Оба супернатанта соединяют, получают 110 мп раствора очищенного Фермента, характеристики которого соответствуют данным, приведенным в табл.2.

Пример 2. Фермент получают так же, как в примере 1, только активирование аскангеля осуществляют по следующей методике. Комерческий материал аскангель помещают в сушильный шкаф и выдерживают при

200 С в течение 4 ч. Полученный бКЛажденный образец используют в каЦНИИИПК Заказ 8430/21 честве активированной глины. Характеристика фермента приведена в табл. табл.2.

Пример 3. Для выделения фермента в лиофильносухом состоянии используют раствор, полученный в примере 2. 230 мл этого раствора смешивают с аскангелем, активированным термообработкой, описанной в примере 2 ° Сорбцию фермента на глину проводят так же, как это описано .в примере 1. Десорбцию осуществляют водой, рН которой доводят до 8,2, добавляя небольшое количество карбоната аммония. Выход фермента после десорбции более

90%. Раствор высушивают лиофильно.

Таким образом, по предлагаемому способу последовательного проведения стадий солевого осаждения и сорбциидесорбции на аскангеле, а также благодаря предварительному активированию аскангеля термообработкой или обработкой кислотой получают декстраназу высокой степени чистоты как по белку,так и по углеводам. Кроме того, обнаружена способность декстраназы сорбироваться на активированном аскангеле из ее растворов; содержащих значительные йримеси соли (сульфата аммония), что позволило вести очистку фермента без применения специальных стадий обессоливания раствора.

1 ° Способ выделения и очистки декстраназы из культуральной жидкости плесневых грибов, предусматривающий сорбцию фермента на минеральном сорбенте при рН 4„0-5,0 и десорбцию его с минерального сорбента при рН

7,0-9,0, о т л.и ч а ю щ и и б я тем, что, с целью повышения степени чистоты препарата и упрощения технологического процесса его получения, перед сорбцией фермент осаждают из культуральной жидкости сульфатом ! аммония, полученный осадок растворяют в воде или буфере, а сорбцию ведут на предварительно активированном минеральном сорбенте, 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве минерального сорбента используют аскангель.

3 ° Способ по пп. 1 и 2, о -. л и— ч а ю шийся тем, что минеральный сорбент активируют концентрированной соляной кислотой или термообработкой.