Способ обработки клеток бактерий,имеющих глюкозоизомеразную активность,перед процессом получения продукта,содержащего фруктозу

Способ обработки клеток бактерий,имеющих глюкозоизомеразную активность,перед процессом получения продукта,содержащего фруктозу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскик

Социапистическик

Республик о 712ОЗО (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлеио 28.08.75 (21} 2168168/28-13 (23) Приоритет — (32) 03.09.74 (51) М. Кл. >

С 12 0 13/10

1 фсудерстеепвй камптт

СССР ве делам азебратеккк а юткрыткм (31) 502619 (33) США

Опубликовано 25.01.80. Бюллетень ¹ 3 (53) УДК 663.18 (088.8) Дата опубликования. описания 05.02.80

Иностранец

Раймонд Ли Снелл (США) (72) Автор изобретения

Иностранная фирма

«Майлз Лабораториз, Инк» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОБРАБОТКИ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ, ИМЕЮЩИХ

ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ, ПЕРЕД ПРОЦЕССОМ

ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТА, СОДЕРЖАЩЕГО ФРУКТОЗУ

Изобретение относится к области биохимии.

Известно, что глюкозоизомеразный фермент может быть использован для каталитического ускорения переработки глюкозы (декстрозы) во фруктозу 1левулезу), которая обладает более высокой способностью подслащивания, чем исходный материал. Глюкоэонзомераза образуется главным образом внутри клеток бактерий, которые растут в процессе их производства. Эти клетки отфильтровывают из культуральной среды м не- посредственно используют в качестве источника .глюкозонзомеразы.

Желательно, чтобы клетки бактерий, обладающих активностью глюкозоизомеразы, могли использоваться в непрерывном про- 15 цессе н.".омер а ци н глюкозы во фруктозу.

Предлагались различные способы иммобилизации фермента для того, чтобы он мог быть повторно использован в непрерывном процессе.

Известен од и н из способов обработки клеток бактерий, имеющих глюкоэоиэомеразную активность 111.

Суть способа заключается в обработке клеток бактерий глутаровым альдегидом.

При этом глюкозоизомераза иммобилиэуется в клетках и клетки могут быть использованы в реакторе с перенашнванием нлн в колонне нзомеризации. Однако установлено, что если клетки бактерий с иммобилизованной глюкоэоизомеразной активностью не будут обработаны перед использованием в качестве катализаторов нэомеризацин, то они не будут иметь удовлетворительную физическую устойчивость, а это ухудшает гидравлические характеристики колонны. В результате получаемый нэомеризованный сироп может иметь нежелательную окраску, а время жизни фермента будет недостаточно продолжительным.

Целью изобретения является придание клеткам бактерий физической устойчивости.

Для этого клетки бактерий, обладающие глюкозоиэомеразной активностью, смешивают при температуре 10 — 27 С с водным раствором глюкозы при рН 8,0, нзмеренном прн 25 С для гндратации клеток и стабилизации рН, образуют слой клеток

712030 и пропускают через него водный раствор глюкозы при 60 С и рН 7,5 — 8,0, измеренном при 60 С, до получении прозрачного раствора и стабилизации рН на уровне 7,5 — 8,0, измеренном при 60 С.

Целесообразно, чтобы водный раствор глюкозы имел декстрозный эквивалент 97—

98 и 30 — 50 вес.% сухих веществ, из которых глюкоза составляет 93 — 96 вес.%, Можно использовать для осуществления этого способа клетки бактерий, . обработанные глутаровым альдегидом, Пропускать водный раствор через слой клеток следует снизу вверх при величице расхода 53 — 61 л/м площади поперечного сечения в 1 мин. Водный раствор глюкозы может содержать кобальт в концентрации 0,0005 м/л, магний ——

0,005 — 0,007 м/л и 0,01 N лимонную кислоту.

Клетки бактерий с глюкозоизомеразной активностью могут быть получены с помощью хорошо известных способов. Предпочтительные энзимсодержащие клетки получают глубинным выращиванием в аэробных условиях культуры Streptomqces olivaceus NNRS 3583 или его мутантов в среде, содержащей соответствующие питательные вещества. Получаемые клетки бактерий отделяют от культуральной среды фильтро.ванием или центрифугированием.

Для иммобилизации глюкозоизомеразы могут быть использованы различные хорошо известные способы. Предпочтительно отделенные клетки бактерий суспендировать в водной среде и смешивать с глутаровым альдегидом в количестве примерно от 0,1 до

60 вес.% (в пересчете на сухое вещество клеток).

Так как обработанные клеткц бактерий, содержащие фермент, обычно вырабатывают в ином месте и раньше того времени, когда получают продукт, содержащий фруктозу, то для хранения и транспортировки клетки обычно высушивают. Такое высушивание до величины влагосодержания примерно 3 — 10 вес.% может быть осуществлено в любом сушильном аппарате при температуре примерно 60 — 70 С. Получаемые аггломерированные высушенные клетки затем сортируют по размеру для последующего использования в слое колонны. Аггломерированную высушенную массу клеток обычно разделяют на небольшие части при минимальном нажиме на клетки. Эти части помещают на сита для получений фракции, которая задерживается на сите 60 меш и проходит через сито 20 меш.

Если приготовленные аггломераты клеток бактерий должны использоваться в производстве сиропа из глюкозы, содержащего фруктозу, то их перед тем как поместить в колонну, обрабатывают согласно изобретению. Если в колон ну за грузить необработанные клетки, то необходимо значительное время до того, чтобы реакция изомеризации стабилизировалась в относительно постоянном состоянии. В течение этого времени получаемый изомеризованный сироп имеет нежелательную окраску. При этом время жизни клеток (физическая устойчивость) короткое.

Соответственно описанному способу клетки прежде всего смешивают с водой или с водным раствором глюкозы. Этот последний раствор может состоять из глюкозы, растворенной в воде. Предпочтителен состав из осахаренного раствора высококачественной глюкозы, получаемого энзиматической переработкой крахмала. Этот раствор глюкозы должен содержать примерно 30-—

50 вес.% растворенных твердых веществ, а также твердые вещества должны содержать примерно 93 — 96 вес.% глюкозы. Глюкозный эквивалент раствора глюкозы составляет примерно 97 — 98. Воду или раствор глюкозы используют в количестве примерно 10 вес. ч. на 1 вес. ч. высушенных клеток. Температура воды или раствора глюкозы составляет примерно 10 — 27 С. В воде или растворе глюкозы может содержаться также кобальт в виде хлорида кобальта в мольной концентрации примерно 0,005, магний в виде гидроокиси магния в мольной концентрации примерно 0,005 — 0,007 и хелатный и буферный агент (лимонная кислота) в нормальной концентрации примерно 0,01. Лимонная кислота является предпочтительной потому,что она образует растворимый хелатный комплекс с ионами кобальта и магния и участвует в образовании буферного действия воды или раствора глюкозы при желаемой величине рН. Вода или раствор глюкозы должпы иметь рН 8,0 измеренный при 25 С. Такую величину рН обычно получают добавлением соответствующего количества едкого натра. Клетки и вода илн раствор глюкозы поддерживаются в контакте при минимальном перемешивании в течение примерно I ч. 3а это время происходит гндрата ция клетки и стабилизация величины ðÍ.

Массу, состоящую из клеток и воды или раствора глюкозы, полученную на указанной стадии, направляют на соответствующую реакционную колонну с двойными стенками для получения слоя, имеющего толщину в отстоявшемся состоянии примерно

89 — 100 см. Перемешивание массы должно быть минимальным для того, чтобы уменьшить всякое механическое повреждение аггломератов клеток. В одном из ва риа нтов изобретения раствор глюкозы того же состава, что и описанные выше, с рН 7,5 — 8,0, замеренным при 60 С, пропускают (при температуре примерно 60 С) снизу вверх через слой клеток при. расходе примерно

712030 в количестве, достаточном для того, чтобы поддерживать р11 раствора на уровне 8,0, замеряемый при 25 "С. Клетки выдерживают в контакте с раствором глюкозы примерно

53 — 61 л/м площади поперечного сечения слоя в 1 мин. Это такой расход, который дает увеличение установившегося объема аггломератов клеток прймерно на 50—

60 об.%. Он также обеспечивает желаемую классификацию и перегруппировку аггломе5 ратов клеток. Когда начинает поступать раствор глюкозы, в рубашку колонны пропускают теплоагент с температурой 60 С. Раствор, выходящий из верхней части колонны, имеет значительное количество окрашивающих веществ, так как он содержит различные остатки клеток бактерий. Горячий раствор глюкозы следует пропускать снизу вверх через колонну до тех пор, пока выходящий поток не станет светлым и пока рН выходящего потока не установится на величине

7,5 — 8,0, измеренной при 60 C. Это требует раствора в количестве примерно равном

2 — 3 об. слоя в E ч в течение 1 — 3 ч. Затем подачу раствора глюкозы прекращают и слою клеток дают отстояться. Для уменьшения количества раствора глюкозы, требуемой для такой предварительной обработки, слабо окрашенную часть выходящего раствора глюкозы можно использовать повторно. Величина рН рециркулируемого материала должна быть доведена до 7,5 — 8,0 и и замерена при 60 С.

В варианте изобретения клетки в колонне реактора первоначально обрабатывают пропусканием водного раствора того же состава, что и водный раствор, описанный выwe, при температуре примерно 10 — 27 С и о рН 8,0 измеренном при 25 С, снизу вверх через слой клеток до тех пор, пока выходящий раствор не станет светлым, à рН не установится 8,0 (измеряется при 25 С). После этого пропускают водный раствор глюко- sS зы того же состава, что и описанный выше раствор глюкозы, снизу вверх через слой при температуре 60 С и рН 7,5 — 8,0, измеренном при 60 С, до тех пор, пока выходящий поток не будет иметь такое же содержание глюкозы, что и входящий поток глюкозы.

Во время указанной выше обработки водный раствор и водный раствор глюкозы рециркулируют через слой. Величину рН рециркулируемого материала доводят до желаемого уровня добавлением щелочи.

Все растворы глюкозы, которые вступают в контакт с клетками бактерий, имеют глюкозоизомеразную активность, которая содержит некоторое количество фруктозы, об д разованной реакцией изомеризации. Следовательно растворы глюкозы, используемые на указанных выше стадиях предварительной обработки, могут быть обесцвечены углем, умягчены ионообмениыми материалами, а затем использованы в качестве компонентов фруктозосодержащих продуктов. б

Клетки, обработанные указанным способом, затем могут быть использованы для получения изомеризованного сиропа. Раствор глюкозы описанного состава может быть пропущен нисходящим потоком через слой при величине рН примерно 80 и температуре примерно 60 С для получения продукта, содержащего примерно 42 — 48 вес.о/О фруктозы, в зависимости от расхода потока. Аггломераты клеток, предварительно обработанные по предлагаемому способу, имеют высокую физическую стабильность и хорошие гидравлические характеристики, вполне подходящие для использоь."..ння в сравнительно толстых слоях (76 — 102 см). Использование клеток, обработанных по известным способам, должно ограничиваться тонкими слоями (1,3 — 10,2 см) при крайне большой площади поверхности.

Пример /. Культуральную среду, содержащую клетки бактерий SE;reptomyces Жчэееи 6ИЯВ3583, получают выращиванием таких клеток в среде, содержащей ксилозу, Величину рН культуральной среды доводят до 8,2 добавлением гидроокиси натрия. Водный раствор глутарового альдегида добавляют в бродильную среду из расчета 7 вес. /o (на сухое вещество клеток в среде). Полученную смесь перемешивают в течение 1,5 ч.

В это время добавляют гидроокись натрия для поддержания величины рН на уровне

8,2. Затем клетки профильтровывают, промывают до рН 8,0 и затем высушивают при

60 — 70 С до содержания сухих веществ 3—

10 вес.о/О. Высушенные клетки фракционируют на сите для получения фракции, которая задерживается ситом 60 меш и проходит через сито 20 меш. Г1олученные отсортированные и высушенные аггломераты клеток бактерий; содержащие иммобилизованную глюкозоизомеразу, затем помешают на хранение при комнатнои температуре перед их дальнейшим использованием.

При необходимости берут 300 г сухих клеток и смешивают с водным раствором глюкозы, полученным энзнматической обработкой крахмала. Этот раствор имеет глюкозный эквивалент 97 и содержит 30 вес растворенных твердых веществ. Твердые вещества содержат 94 вес.о/, глюкозы. Температура раствора 10 — 27 С. Его используют из расчета 10 вес. ч. на 1 вес. ч. высушенных клеток. В растворе также содержится хлорид кобальта в концентрации

0,0005 м/л, гидроокись магния в концентрации примерно 0,005 — 0,007 м/л и лимонная кислота в нормальной концентрации примерно 0,01. В него добавляют гндроокись натрия

712030

f$

2S

40 в течение ч, для их гидратации и выравнивания рН.

Г!олученную массу клеток н раствор глюкозы направляют в реакционную колонну диаметром 3,75 см, снабженную рубашкой, и образуют слой клеток толщиной примерно 89 — 100 см. Перемешивание массы должно быть минимальным для того, чтобы уменьшить всякое механическое повреждение гидратированных клеток. Раствор глюкозы того же состава, что описанный выше, с рН 7,5 — 8,0. (измерен.при 60 C) про-10 пускают при 60 С снизу вверх через слой клеток при расходе потока 53 — 6! л/м площади поперечного сечения в мин.

При поступлении в раствор глюкозы в слой через рубашку колонны пропускают теплоагент с температурой 60 С. Горячий раствор глюкозы пропускают снизу вверх через колонну в течение 1 ч до тех пор, пока выходящий раствор не становится светлым и величина рН не устанавливается на уровне 7,5 — 8,0 (измеряют при 60 С).

Затем подачу раствора глюкозы прекращают и клеткам дают отстояться в течение

15 — 20 мин. Во время указанной обработки раствор глюкозы рециркулируют через слой клеток. Величину рН рециркулируемого раствора глюкозы поддерживают равной

7,5 — 8,0 (измеряют при 60 С) путем добавления гидроокиси натрия. Во время обработки величину рН нельзя уменьшать ниже

7,0,так как это может привести к физическому повреждению аггломератов клеток.

После этого слой клеток готов к использованию для изомеризации глюкозы во.фруктозу.

Раствор глюкозы того же самого состава, что и описанный выше, пропускают самотеком при напоре примерно 10,2 — 15,2 см через указанный слой при температуре 60 С и расходе примерно равном 1,5 объемам слоя в 1 час. В этом случае расход составляет примерно 22 л/м площади поперечного сечения в I ч. Величину рН раствора глюкозы поддерживают равной 8 (замеряемой при 60 C) путем добавления гидроокиси натрия. Получают изомеризованный сироп, содержавший примерно 42 — 43 вес,% фруктозы в пересчете на вес растворенных твердых веществ, не имеющий окраски и не содержащий псикозы (psicose). Когда расход подачи сиропа глюкозы уменьшают до

I,I об. слоя в 1 ч (!6,3 л/м в 1 ч), то получают продукт, содержащий примерно

45 — 46 вес.% фруктозы (в пересчете на вес растворенных твердых веществ!и»имеющ,ийй окраски и не содержащий глюкозы.

Указанный слой клеток использовали непрерывно лля изомеризации в течение бо-. лее 1000 ч и при этом активность аггломера-. тов клеток уменьшились весьма незначительно .

При использовании клеток, не обработанных по описанному способу, они теряли по меньшей мере половину своей энэимной активности примерно после 500 — 600 ч непрерывной работы.

Пример 2. Аналогично примеру получают порцию отсортированных по размеру аггломератов клеток бактерий (300 г), содержа ших иммобилизованную глюкозоизомеразу. Приготавливают водный раствор, со держащий хлорид кобальта в концентрации примерно 0,0005 м/л, гидроокись магния в концентрации примерно 0,005 — 0,007 м/л, лимонную кислоту в нормальной концентрации примерно 0,0! и гидроокись натрия, в количестве, достаточном для поддержания величины рН на уровнях, измеряемой при температуре 25 С. Затем высушенные клетки смешивают с этим аодным раствором при

lO — 2ГС в количестве 10 вес. ч. воды на

1 вес. ч. высушенных клеток. Последние поддерживают в контакте с водным раствором в течение примерно ч.

Полученную массу клеток и водного раствора направляют в реакционную колонну диаметром 3,75 см, снабженную рубашкой, и образуют слой клеток толщиной примерно

100 см. Водный раствор того же состава с рН 8,0 (измерен при 25 С) пропускают при температуре 10 — 27 С снизу вверх через слой клеток при величине расхода 53 — 6! л/м плогцади поперечного сечения в 1 мин.

Водный раствор пропускают снизу вверх через колонну примерно в течение 1 ч до тех пор, пока выходящий поток не станет светлым, а величина рН выходягцего потока .не стабилизируется на уровне 8,0 (измеряют при 25 С). Подачу водного раствора прек ра гца ют.

Затем водный раствор, описанный в примере 1, при 60 С и рН 7,5 — 8,0 (нзмеряют при 60 С) пропускают снизу вверх через слой клеток при величине расхода 53 — 61 +» площади поперечного сечения в 1 мин до тех пор, пока состав выходящего из слоя раствор. не будет таким же как и входящий раствор глюкозы. При поступлении раствора глюкозы в слой клеток через рубашку колонны пропускают теплоа гент с температурой

60 С. Подачу раствора глюкозы прекращают и слою клеток дают отстояться в течение примерно 15 — 20 мин. Во время указанной обработки водный раствор и последующий раствор глюкозы рециркулируют через слой клеток, Величины рН рециркулируемых водного раствора и иоследуЮгцего раствора глюкозь. поддерживакгг соответственно на уровне 8,0 (измеряют ири 25"С) и на уров-. не 7,5 — 8,0 (измеряют ирн 60 С) путем добавления гидроокиси ивгрия.

42 030

1О

Формула изобретения

Составители М. Андреева

Редактор A. Бер Текред . Шуфрнч Корректор М. Демчнк

Заказ 9652/45 тираМ 33 Подписное

ЦИ И И ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

1 l 3035, Москва, ٠— 35, Раушская наб., д. 4/5

Фнанал П ПП е Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Ъ

Полученный обработанный слой клеток затем используют для изомеризации глюкозы во фруктозу способом, описанным в примере 1, для получения изомеризованного сиропа, содержащего примерно 42 — 43 вес.% фруктозы, не имеющего окраски и не содержащего псикозы. Обработанный указанным способом слой клеток физически .устойчив.

l. Способ обработки клеток бактерий, имеющих глюкозоизомеразную активность, перед процессом получения продукта, содержащего фруктозу, отличающийся тем, что, с целью придания клеткам бактерий

25 С для гидратации клеток и стабилизации рН, образуют слой клеток и пропуска- > ют через него водный раствор глюкозы при температуре 60 C и рН 7,5 — 8,0, измеренном при 60 С, до получения прозрачного раствора и стабилизации рН на уровне 7,5—

8,0,измеренном при 60"С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор глюкозы имеет декстрозный эквивалент 97 — 98 н 30 — 50 вес.% сухих веществ, из которых глюкоза составляет 93 — 96 вес.%.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют клетки бактерий, обработанные глутаровым альдегидом.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор глюкозы пропускают через слой клеток снизу вверх при величине расхода 53 — 61 л/м площади поперечного сечения в l мнн.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что водный раствор глюкозы содержит кобальт в концентрации 0,0005 м/л, магний — 0,005—

0,007 м/л и 0,01 N лимонную -кислоту.

Источники информации, принятые во вни иание при экспертизе

l. Патент Великобритании № 1376983, кл. С 3 Н, опублнк. 1971.