Способ получения лизоцима

Способ получения лизоцима

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

) @per i

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

<"1 712438 (61) Дополнительное к авт. свмд-ву (22) -Заявлено 100377 (21) 2462874/28-13 (51)М. ((л.2 с присоединением заявки Мо

С 12 D 13/10

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 300180, Бюллетень М9 4

Дата опубликования описания 300 1,80 (53) УДН 577 15 (088. 8) И.A.Áðóíñ, В.П.Замах, У.Я.Каулиньш, Р.А.Ласманович, A.Â.Ïóðâèíÿ и A.ß.Ñòåïêà (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОЦИМА

30

Изобретение относится к способу получения лизоцима, широко применяемого в разных областях народного хозяйства, в частности в пищевой про- 5 .мышленности, медицине, микробиологии.

Известны различные способй полУ чения лизоцима из животного и микробиологического сырья. Наиболее доступным сырьем животного происхожде- () ния для выделения лиэоцима является яичный белок. Согласно известному способу (1) получения лиэоцима иэ. яичного белка исходное сырье обрабатывают раствором хлористого натрия и едкого натра, осуществляют кристаллизацию фермента из раствора и отделяют кристаллы иэ стабилизированного раствора фильтрацией, при этом кристаллизацию фермента осуществляют трехкратной перекристаллиэацией.

Выход лиэоцима от общего его количества в яичном белке — 80-95%, температура хранения 3-4оС.

Недостатками известного способа являются сложность и длительность процесса, что ведет к тому же к потерям ферментного препарата. Препарат малоустойчив при температуре

18-23оС, поэтому его необходимо хранить при низкой температуре, Цель изобретения — получение устойчивого при хранении раствора препарата и упрощение процесса его получения °

Для достижения этой. цели согласно предлагаемому способу кристаллизацию фермента иэ раствора ведут в течение 4-6 суток, после отделения кристаллов лиэоцима рН раствора препарата устанавливают равным 3,55,0 и стабилизируют раствор хлористым натрием и альбумином, которые берут в соотношении 1-15:l.

Целесообразно установить ".оотношение лизоцима и хлористого натрия равным 1,00-1,25:1,00-5,00, а соотношение лизоцима и альбумина

1 0:0,4-0,9.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Яичный белок обрабатывают растворами хлористого натрия и едкого натра с последующим отделением кристаллов лизоцима иэ раствора фильтрацией, перекристаллнзацией и стабилизацией ферментного препарата солью одновалентного катиона, напри712438 мер, натрием хлористым или альбумином. В качестве стабилизатора используют комплекс натрия хлористого и альбумина. При этом натрий хлористый вводят в суспензию лиэоцима, содержащую альбумин, сразу же после первой перекристаллизации, не выделяя целевой продукт из раствора, при одновременном установлении значения, рН 3,5-5,0; соотношение натрия îристого и. альбумина 1-15: 1, соотношение лизоцима и натрия хлористого 1-1,25:1,0-5,0.

Предлагаемый способ получения лизоцима обеспечивает упрощение процесса в результате исключения двух стадий перекристаллизации, обессоливания и высушивания. Это дает экономию рабочего времени до 70% и снижает потери конечного продукта на 4-6-.

Использование в качестве стабилизатора комплекса натрия хлористого .и альбумина в соотношении 1-15:1 (соотношение лизоцима и натрия хлористого в суспенэии 1-1,25:1,0-5,0) дает возможность получать ферментный препарат, устойчивый при хранении при температуре 18-23 С.

Известно, что одно-, двух-, трехвалентные катионы, в том числе натрий хлористый, в микроколичествах являются необходимыми активаторами лизоцима. Однако не .обладает свойствами ст абилиз атор а.

В качестве .стабилизатора предложено использовать высокие концентрации натрия хлористого (4-303 от общего сухого веса) и сочетании с альбумином при рН 3, 5-5, 0 и концентрации фермента в суспензии 4-6%, При значениях рН 8,0-9,0 натрий хлористый подавляет ферментативную активность уже при концентрации

50 мМ. При низких значениях рН (3,5-5,0) снижается ингибирующее действие натрия хлористого.

Лизоцим с альбумином образуют комплекс, который улучшает его устойчивость и увеличивает активность.

В нейтральных средах при рН 7,0-6,0 комплекс наиболее устойчив.

При снижении рН устойчивость комплекса снижается, и лизоцим сравнительно легко может высвободиться из комплекса. Таким образом, альбумин одновременно является стабилизатором, при рН 3,5-5,0 не блокирует активность .лизоцима, что важно при практическом его применении.

При соотношении лизоцима и натрия хлористого 1-1,25:1-5 имеет место одновременная стабилизация и стерилизация фермента, так как исключается развитие прсторонней микрофлоры, Пример. К 80 л яичного белка при перемешивании добавляют 4,5 кг натрия хлористого и добавляют 1 н, Раствор едкого натра до значения

2О

39

55 рН 9,5. При достижении рН 9,5 дополнительно добавляют натрий хлористый иэ расчета 52,2 г на каждый литр добавленного раствора едкого натра, чтобы конечная концентрация приготовленного раствора была 5%. Полученный раствор фильтруют. К однородноМу раствору добавляют 1-2 г кристаллического лизоцима (в качестве затрав ки) . Процесс кристаллизации лизоцима завершается через 4-6 суток при температуре 2-5 С. Суспензию кристал лов центрифугируют при 2500 об/мин, 2-5ОС в течение 30 мин. Выход.—

4,0 л суспенэии из кристаллов лизоцима.

Приготовление стабилизированного лизоцима. К 4,0 л суспенэии добавляют

5 н.раствор уксусной кислоты, доводят значение рН до 4,0. При этом расходуют 1, 12 л 5 н.раствора уксусной кислоты. Содержание натрия хлористого в суспенэии после доведения рН до 4, 0 составляет 4, ОЪ . Дополнительно добавляют при перемешивании 252 г натрия хлористого, т.е. до содержания Нас Е 10З.

По электрофоретическим данным белок суспензии состоит из 62% лиэо-. цима и 38% яичного альбумина (.соотношение 1:0,61). Соотношение лиэоцима и альбумина является оптимальным и не требует изменений. Срок хранения и транспортировка стабилизированной суспенэии лизоцима при температуре

18-23 С составляет 6 месяцев.

Формула изобретения

1. Способ получения лизоцима из яичного белка, предусматривающий обработку исходного сырья раствором хлористого натрия и едкого натра, кристаллизацию фермента иэ раствора и отделение кристаллов из стабили-. зированного раствора фильтрацией, отличающийся тем, что, с целью получения устойчивого при хранении раствора препарата и упрощения процесса его получения, кристаллизацию осуществляют в течение 46 суток, после отделения кристаллов лизоцима рН раствора препарата устанавливают равным 3,5-5,0 и проводят стабилизацию раствора хлористым натрием и альбумином, взятых в соотношении 1-15:1.

2. Способ по и ° 1, о т л и ч а ю шийся тем, что соотношение лизоцима и хлористого натрия устанавливают равным 1,00-1,25:1,00-5,00, 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что соотношение лиэоцима и алъбумина устанавливают

1,0:0,4-0,9, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

9247703, кл. С 12 D 13/10, 1968 {про,тотип),