Штамм @ @ @ @ @ . @ .

Штамм @ @ @ @ @ . @ .

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ШТАММ KICROMONOSPORA FUSCA 'VAR. SIS01JIYCINI VAR. NOV. 15-72-ПРО- ДУЦЕНТ СИЗОМИДИНА, хранится в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков под номером 15-72 и характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и антибиотическими свойствами.Культурально-морфологические признаки. Спороносны отхо'дят от веток субстратного мицелия. Воздушный мицелий не образуется. Споры круглые с бугристой поверхностью, размером 0,8-1,0р, располагаются на конце коротких спороносцев, часто образуя гро.зди.'Среда Чапека. Рост удовлетворительный. Колонии оранжево-ржавые до темно-коричневого. Растворимый пигмент отсутствует.Минеральная среда № 1 Гаузе. Рорт обильный. Колонии гнедые до черного цвета. Растворимый пиг^^ент отсутствует.Агар Беннета. Рост обильньй. Колонии коричневого до черного цвета. Растворимый пигмент отсутствует.Овсяной агар. Рост обильный. Колонии темно-каштанового до ржавого цвета. Растворимьй пигмент отсутствует.Соевый агар. Рост обильный. Колонии темно-каштанового цвета с металлическим блеском. Растворимый пигмент умбрового цвета.Ломтики картофеля. Рост хороший. Колонии черные. Растворимый пигмент . отсутствует.Физиолого-биохимические признаки. . Оптимальная температура роста 26-34''С. При 50''С не растет. Желатину разжижает умеренно.Молоко коагулирует быстро.Крахмал гидролизует умеренно.Меланиды не образует.Отношение к углеводам.^Усваивает хорошо сахарозу, маннит, крахмал, слабо галактозу. Не усваивает арабинозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, раф- .финозу, инозит, сорбит.Антибиотические свойства.Подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий Staph.aureus. Вас. subtilis. Вас. raycoi- des, Mycobacterium pulli, Sarcina. lutla, E. coli, Pseudomona aerugino- sa, Proteus vulgaris, Comamonas ter- rigena, Providencia\stuartii.(Л^CO^

713170 A

COOS СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2457553/28-13 ..(22) 01.03.77 (46) 23.11.86. Бюл. Р 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (72) Л.П. Иваницкая, М.В. Бибикова, Н.П. Фадеева, Э.М. Сингал, С.Н.Востров, Ю.В. Жданович, P Н. Елизарова, А.Д. Кузовков, А.Н. Лобусева, И.П. Фомина, С.M. Навашин, А.В.Владимиров, Ю,Э. Бартошевич, Т.Н. Лазникова, Н.В. Орлова, А.С. Тихонова, С.М. Чайковская и Б.В. Розынов (53) 615. 45: 615. 779. 931 (088. 8) (56) Патент США Р 3907771, кл. 195-80, опублик. 1968. (54) (57) ШТАММ МТСРОМОНО$РОВА FUSCA с7АК, $Т$ОИУСТИ? VAR. NOV. 15-72-ПРОДУЦЕНТ СИЗОМИЦИНА, хранится в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института антибиотиков под номером 15-72 и характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и антибиотическими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Спороносцы отходят от веток субстратного мицелия. Воздушный мицелий не образуется. Споры круглые с бугристой поверхностью, размером

0,8-1,0, располагаются на конце коротких спороносцев, часто образуя грозди, Среда Чапека. Рост удовлетворительный. Колонии оранжево-ржавые до темно-коричневого. Растворимый пигмент отсутствует.

A@4 С 12 Р 1/02, С 12 R f/29

Минеральная среда Р I Гаузе. Рост обильный. Колонии гнедые до черного цвета. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Беннета. Рост обильный. Колонии коричневого до черного цвета.

Растворимый пигмент отсутствует.

Овсяной агар. Рост обильный. Колонии темно-каштанового до ржавого цвета. Растворимый пигмент отсутствует °

Соевый агар. Рост обильный. Колонии темно-каштанового цвета с металлическим блеском. Растворимый пигмент умбрового цвета. С2

Ломтики картофеля. Рост хороший.

Колонии черные. Растворимый пигмент . отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки. С

Оптимальная температура роста 26-34 С.

При 50 С не растет. Желатину разжижает умеренно.

Молоко коагулирует быстро.

Крахмал гидролизует умеренно. М

Меланиды не образует.

Отношение к углеводам.оусваивает CQ хорошо сахарозу, маннит, крахмал, слабо галактозу. Не усваивает арабинозу, лактозу, рамнозу, ксилозу, раф- ( финозу, инозит, сорбит.

Антибиотические свойства.

Подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий Staph.

aureus, Вас. subtilis, Вас. mycoi des, Mycobacterium pulli, Sarcina.

lutla, E. coli, Pseudomona aeruginosa, Proteus vulgaris, Сошашопаз terrigena, Providencia(stuartii.

? 13170

Изобретение относится к медицине и касается получения антибиотиков.

Известен штамм Nicromonospora

inyoensis NRRZ 3292 — продуцент сизомицина.

Недостатком данного штамма является низкий уровень активности культуральной жидкости. .Цель изобретения — повьппение активности культуральной жидкости.

Поставленная цель достигается путем использования штамма Nicromonospora fusca var. sisomycini var. nov.

15-72.

Штамм Micromonospora fusca var.

sisomycini var. nov. 15-72,выделен из лугово-каштановой оглееной почвы

Крыма в районе Саки, депонирован и хранится в коллекции культур Всесоюзного научно-исследовательского института под номером 15-72 и характеризуется следующими культуральноморфологическими, физиолого-биохимическими и антибиотическими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Спороносцы отходят от веток субстратного мицелия. Воздушный мицелий не образуется. Споры круглые с бугристой поверхностью, размером

0,8-1 0@, располагаются на конце коротких спороносцев, часто образуя грозди.

Штамм хорошо развивается на большинстве агаризованных сред. Субстратный мицелий оранжево-ржавый до коричнево-черного цвета. Растворимый пигмент на большинстве сред отсутствует. На соевой агаризованной среде образуется умбровый пигмент.

Среда Чапека. 20 дней выращивания при 28 С, Рост удовлетворитель" ный. Колонии оранжево-ржавые (М-1) до темно-коричневых (Л-5) ° Здесь и далее окраска определена по таблице цветов Бондарцева. 1951 .r. Растворимый пигмент отсутствует.

Глюкозо-аспарагиновый агар. 20 дней выращивания при 28 С, Рост хороший. Колонии темно-каштановые (О"7).

Растворимый пигмент отсутствует.

Крахмальный агар с растворимым крахмалом. 20 дней выращивания при

20 С. Рост обильный. Колонии темнокаштанового до буро-красного цвета (0-7 — В-1). Растворимый пигмент отсутствует.

Минеральная среда N - 1 Гаузе. 20 пней выращивания при 28 С. Рост обиль:ный. Колонии гнедые до черного цвета, (В-2 — А-1). Растворимый пигмент отсутствует.

Агар Беннета. 20 дней выращивания при 28 С. Рост обильный. Колонии коричневого до черного цвета (Л-5 — А-1). Растворимый пигмент отсутствует.

Овсяной агар. 20 дней выращивания при 28 С. Рост обильный. Колонии . темно-каштанового до ржавого цвета (0-7 — Ж-1). Растворимый пигмент

15 отсутствует.

Мясо-пептонный агар. 20 дней выращивания при 28 С. Рост отсутствует.

Агар с тирозином. 20 дней выращивания при 28 С. Рост слабый. Пигмент

20 отсутствует.

Соевык агар. 20 дней выращивания при 28 С. Рост обильный. Колонии темно-каштанового цвета с металлическим блеском (0-7). Растворимый пигмент умбрового цвета (П-2).

Ломтики картофельные. 20 дней выращивания при 28 С. Рост хороший. Колонии черные. Растворимый пигмент отсутствует.

Культура сохраняется на агаризованных средах под слоем вазелинового масла, на скошенном агаре при 5 С в о течение 6 мес.

Физиолого-биохимические признаки.

Оптимальная температура роста

26-34 С.

При 50 С не растет.

Желатину разжижает умеренно (1421 день).

Молоко коагулирует быстро (5-7 день).

Крахмал гидролизует умеренно (14 дней)..

Меланиды не образует (агар Треенера с лимоннокислым железом).

Использование различных источников углерода (среда Придхе ма-Готтлиба).

Хорошо растет в присутствии сахарозы, маннита и крахмала. Очень слабо — в присутствии галактозы. Не растет в присутствии арабинозы, лактозы, рамнозы, ксилозы, раффинозы, инозита и сорбита.

Антибиотические свойства.

Культура 15-72 при культивировании в жидкой питательной среде в колбах на качалках (в ферментерах) на

4-5 сутки образует антибиотик, подавз 7131 ляющий рост различных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий (Staph.. aureus,Âàñ. subtilis, Вас. mycoides,Mycobac terium pulli, Sarcina lutea, Е. coli, Pseudomonas

aeruginosa, Proteus Vulparis, Comamonas terrigena; Providencia зСиат 1ъ) и не задерживает рост дрожжей и мицелиальных грибов Candida allicans, Saccharomyces cerevisiae, Torula 10

utilis Aspergillus niger, Penicillium notatum.

На 10-12 сутки роста культура образует противоопухолевой антибиотик, который обладает действием in vitro только в отношении грамположительных бактерий, а in vivo подавляет рост ряда экспериментальных опухолей.

Пример 1. Агаровым блоком из 10-14 суточной культуры Micromonospora vac, sisomycini var. nov.

15-72, выращенных на минеральной среде Гаузе Р 1, засевают маточную колбу с посевной средой следующего состава, X: 25

Кукурузный экстракт 1 (технич. вес)

Сернокислый аммоний 0,35

Крахмал 1,5

Глюкоза 1

Хлористый натрий 0,5

Углекислый кальций 0,5

Значение рН среды 7,0, объем среды в колбах 100 мл; выращивание на качалках при 280 об/мин при 34 С в

35 течение 72 ч. Мицелий из маточной колбы переносят в посевные колбы со

100 мл среды указанного состава.

Культивирование посевных колб ведут так же, как и маточных. Мицелий из посевных колб используют в качестве инокулята при биосинтезе сизомицина в ферментерах или в колбах. Инокулят может быть получен также в ферментерах-инокуляторах.

Для ферментации используют среду следующего состава, X:

Соевая мука 3

Крахмал 4,5

Сахароза 2 50

Натрий азотнокислый 1

Кальций углекислый 0 5

Кобальт хлористый 0,8 мг/л

Значение рН среды 7,0.

А). Ферментация на качалках: 96 — 55

120 ч, 280 об/мин, 34 С, получают культуральную жидкость с содержанием

270 мкг/мл сизомицина.

70 4

Б). Биосинтез в ферментерах: засев в ферментерах производят инокулятом, взятым в количестве 10Х от объема ферментационной среды, ферментацию ведут при 34 С в течение

96-120 ч, получают культуральную жид кость с содержанием 270-300 мкг/мл сизомицина.

По окончании ферментации 50 мл культуральной жидкости подкисляют щавелевой кислотой до рН 1,5-2,0, . перемешивают 30 мин и фильтруют.

Фильтрат культуральной жидкости нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 6,5-7,5. 45 л нейтрализованного фильтрата культуральной жидкости пропускают через колонку с 250 мл катионита КБ-2 в аммонийной форме. IIo окончании сорбции колонку промывают водой и десорбируют сизомицин 2 н. водным раствором аммиака. Получают

600 мл элюата, который упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в минимальном количестве воды, подкисляют разбавленной серной кислотой до рН 4,0-4,5, осветляют раствор активи-. рованным углем и осаждают из раствора сульфат добавлением 10-кратного количества метанола. Получают 24 г препарата с содержанием около

360 мкг/мг сизомицина основания (8,6 r в пересчете на основание сизомицина). Неочищенный сульфат растворяют в минимальном количестве воды и вносят в колонку с 800 мл анионита

JRA=401S. Антибиотик вымывают дистиллированной водой. Элюат упаривают досуха. Остаток растворяют в смеси изопропанол-хлороформ-,25Х-ный аммиак (1:1:1 нижняя фаза), вносят в колонку с 500 г силикагеля марки КСК (или водной кремневой кислоты) и хроматографируют в той же системе. Фракции, содержащие сизомицин, объединяют, упаривают досуха. Остаток растворяют в минимальном количестве воды, раствор подкисляют разбавленной серной кислотой до pI 4,5, осветляют активированным углем. Сульфат сизомицина осаждают добавлением к раствору 10-кратного количества метанола. Получают 7,8 гсульфата сизомицина с содержанием 600 MIcp/ìë основания сизомицина (в пересчете на основание 4,8 r).

Пример 2. Агаровым блоком из

10-14 суточной культуры Micromono—

spora fusca var. sisomycini var. nov.

15-72 засевают маточную колбу с

13170 6

5 7 посевной средой следующего состава, X . !

Кукурузный экстракт 0,7 (технич.

5%

2,51

1 (технич. вес)

0,2

1,2

1,5 мг/л

Натрий хлористый

Кальций углекислый

Кобальт хлористый

Значение рН среды 7,0.

A), Ферментация на качалках: в колбы а 750 мл наливают по 50 .мл среды засевают по 5 мл инокулята, У о биосинтез ведут при 34 С в течение

72-96 ч, получают культуральную жидкость с содержанием 3?0 мкг/мл сизомицина.

Б). Биосинтез в ферментерах: засев производят инокулятом, взятым в количестве 10 от объема ферментационной среды, ферментацию ведут при

34 С 72-96 ч. Получают культуральную

Корректор Е. Рошко

Редактор П. Горькова Техред И.Попович

Заказ 6499/3

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 вес)

Крахмал 2,5

Углекислый кальций О, 8

Сернокислый аммоний о 0,35

Хлористый натрий 0,5

Значение рН среды 7,0, объем среды в колбах 100 мл выращивание на каЭ о чалках при 280 об/мин при 34 С в течение 72 ч. Мицелий из маточных колб переносят в посевные колбы с 100 мл среды, указанного состава. Культивирование посевных колб ведут так же, как и маточных. Мицелий из посевных колб используют н качестве инокулята при биосинтезе сизомицина н ферментерах или в колбах. Инокулят может быть получен в ферментерах-инокуляторах.

Для ферментации используют срецу следующего состава:

Соевая мука

Крахмал

Сахароза

Кукурузный экстракт жидкость с содержанием 320 мкг/мл сизомицина.

По окончании ферментации 50 л культуральной жидкости подкисляют щавелевой кислотой до рН 1,5-2,0, перемешивают 30 мин и фильтруют.

Фильтрат культуральной жидкости нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 6,5-7,5. 45 л нейтрализованно10 го фильтрата культуральной жидкости пропускают через колонку с 250 мл катионита КБ-2 н натриевой форме. По .окончании сорбции колонку промывают водой и десорбируют сизомицин 1 .н.

1 водным раствором серной кислоты.

Элюат нейтрализуют анионитом ЭДЭ-10 в ОН форме до рН 6,5-7,0, затем перемешивают с углем в течение 30 мин, уголь отфильтровывают. Фильтрат про20 пускают через колонку с 150 мл катионита КУ-2-20 н Н форме, колонку промывают водой, объединенные элюаты нейтрализуют анионитом ЭДЭ-i в Oli форме до рН 6,5-7,0. Нейтрализован25 ные элюаты упаривают при пониженном давлении до небольшого объема, подкисляют 10%-ной серной кислотой до рН 4,0-4,5, добавляют активированный уголь, перемешивают 20 мин, после

30 чего уголь отфильтровывают. Фильтрат выливают в 10-кратное количество метанола. Выпавший осадок сульфата сизомицина отфильтровывают. Получают около 20 г препарата с содержанием

360 мкг/мг сизомицина основания (7,2 r н пересчете на основание сизомицина).

Предлагаемый штамм Micromonospora

musca var. sisomycini var. nov. 15-72 при ферментации на одной из оптимальных сред позволяет получить 7,5-8,0

r сизомицина сульфата, содержащего около 600 мкг/мг сизомицина основания из 50 л культуральной жидкости.