Способ получения антибиотика в 508

Способ получения антибиотика в 508

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Ссноз Советских

Соцмалистичееиик

Реснублии (6!) Дополнительный к патенту (22} Заявлено 2906,77 (2(}2497857/28-13 (23} Приоритет - (32) 30,06,76 (51) М. Кл.

С 12 Р 9/00

Гоеуларе«««енннй коми«ет

ГССР но «еоич изобретений и «1тирнтнй (8(} 701395 (38) США (5З) УДК 6 1 5 779

° 331(088.8) Опубликовано 05.0280.Бюллетень И

Дата опубликования описания 080280

Иностранцы () втори

Джон Генри Эдвард Джеймс Мартин и Картин Роуд Херц изобретения (США) Иностранная фирма Американ Пианамид Компани (США) P3) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА В Ь 508Ь технической литературе не описан.

СН ИЗ и К

ОСН <И

Н ен о сн н 0

К

Н.О

Н С Н ! со к

Изобретение относится к области микробиологии и касается синтеза нового антибиотика, способ получения которого в патентной и научноН

0 заключается в том, что штамм Ыгер1опззсеь Мс гоэсор1cus 8180 выращивают в азробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта.

Штамм St. )зэр оэсорзс«зэ 8180 — продуцент антибиотика в 4508 является мутантом, полученным путем обраПредлагаемый способ получения

5 антибиотика формулы ботки St.b>grascopicus HRRL 5647

N-метил-N-нитро-N-нитроэогуанидином, Штамм депонирован в лаборатории культур Северного отделения по использованию исследований и развитию сель скохоэ яйст венного Департ амен та

США, и Пеории, Иллинойс под номером

NRR L 8180, Культурально-морфологические признаки.

715034

На агаре с овсяными хлопьями Êañтера воздушный ммцелий дает спороносные ветви, оканчивающиеся плотно свернутыми спиралями из нескольких виткон. Споры большей частью некруглйе, сустанчатой формы, Размер спор

0,6-0,8 мкм. Поверхность спор гладкая, Оболочки спор тонко морщинистые, Агар Чапека, Рост слабый. Следа беловатого воздушного мицелия. Спорообразования нет, Растворимый пигмент отсутствует, Субстрактный мицелий от бесцнетного до белонатого.

Среда с дрожжевым экстрактом.

Рост хороший. Воздушный мицелий беловатый, от светло- до темно-коричневого в зонах спорообраэонания,Спорообразонание обильное. Растворимый пигмент желтоватый. Субстрактный мицелий желтый, Черноватые гигроскопические поверхности в центральных зонах колоний, Среда с аспарагином-декстроэой, Рост умеренный. Воздушный мицелий беловатый, от пепельного до снетлокоричневого в зонах спорообразования. Спорообраэование умеренное.

Растворимый пигмент отсутствует „

Субстрактный мицелий желтый, Черноватые гигроскопические поверхности н центральных зонах колоний, Среда с крахмалом. Рост умеренный

Воздушный мицелий от беловатого до желтоватого, от светло- до темнокоричненого в зонах спорообразонания

Спорообраэонание обильное, Растворимый пигмент отсутствует. Субстрактный мицелий пастельно-желтый. Черноватые гигроскопические поверхности и центральных зонах колоний, Агар Беннета, Рост умеренный, Воздушный мицелий беловатый„ Темно-коричневый в зонах спорообразования.

Растворимый пигмент желтоватый, Субстрактный мицелий желтый. Черноватые гигроскопические поверхности в центральных зонах колоний, Агар-картофель-декстроза, Рост хороший, Воздушный мицелий от беловатого до желтоватого, от пепельного до светло-коричневого н зонах спорообраэования, Спорообраэование умеренное. Растворимый пигмент желтоватый, светлый, Субстрактный мицелий желтовато-зеленый, Черноватые гигроскопические поверхности в центральных зонах колоний.

Физиолого-биохимические признаки.

Нитраты восстанавливает н нитриты. Желатину разжижает полностью, меланоидных пигментов не образует .

На седьмые сутки молоко пентонизирует полностью.

Переносимость ИаСС в культуральной среде 7-10%, Хорошо усваивает адонитол, d -галактоэу, д -фруктозу, d -рафинозу, салицин, д -ксилозу и декстрозу.

1О

Плохо усваивает д-мелезитозу, d -мелибиоэу, Не усваивает Г -арабиноэу, f,-инозитол, лактозу, д-маннитол, g-рамнозу, сахароэу и д -трегалозу.

Культивирование штамма

Ы. $1Jg I oscoP1cus ARRL 8180 пронодят в очень разнообразных средах, содержащих усваиваемые источники углерода, н апример, крахмал, сахар, мелассу, глицерин, азота,, например белок, белковый гидролизат, полипептиды, аминокислоты, кукурузный настой, минеральные соли, например соли калия натрия, кanьция, сульфаты, Фосфаты, хлориды. Микроэлементы, например бор, молибден, медь поступают нместе с другими компонентами среды, Аэриронание проводят поверхностным или глубинным методом при перемешинании механической мешалкой, иногда с добавлением антинспенивателя например

1% октадеканола в олеомаргарине.

Посевной материал И.Ищгoscapicus готовят путем заражения 100-мл порций стерильной среды н 500-мл колбах соскаблинанием или смыванием спор с косого агара культуры. Обычно применяют следующую .среду,нес.%:

Соевая мука 1,0

Глюкоза 2,0

Кукурузный настой 0,5

Карбонат кальция 0,3

Вода Остальное, Колбы инкубируют при 25-29 С, предпочтительно при 28 С, и интенсивно взбалтынают н течение 48-96 ч.

Двумя 100-мл порциями посевного материала засевают 12 л стерильной среды н 20-л бутылях и перемешивают при аэрации и 25-29 С,предпочтительно 28 С„ в теченне 36-64 ч.

Полученным материалом засевают

300 л той же стерильной среды в ферментере, перемешивают в течение

36-64 ч при 25-29 С, предпочтительно при 28 С, и аэрации .

Этот посевной материал используют для засенания 4000- л ферментера содержащего 3000 л стерильной среды, имеющей следующий состав, нес.%:

Кукурузный настой 0,5

Соевая мука 1 0

Крахмал кукурузный 4,0

Карбонат кальция 0,1

Вода Остальное.

Эту среду Ферментируют 100-200 ч при 27-32 С, перемешинании мешалкой и аэрации (0,4-0,8 л воздуха в 1 мин на 1 л ореад ), Добавляют антинспениватель, например Ходаг FD 82, в количестве 1,3 ч. на 1000 ч. среды

Полученную массу, содержащую антибиотик Вь 508, смешивают с половинным объемом этилацетата и перемешивают 2-3 ч, Добавляют 8Ъ диатомитовой земли, фильтруют на рамном фильтрпрессе, фильтровальный жмых промывают н фильтрпрессе этилацетатом, фильтрат и промывки концентри715034 руют до сиропообразного состояния, перемешивают с двойным объемом гептака и оставляют на ночь при 4 С.

Верхний слой декантируют и концентрируют до получения смолистого остатка, Смолистый остаток обрабатывают

10 л метанола и несколько часов охлаждают сухим льдом, фильтруют через спеченное стекло„ покрытое диатомитовой землей, и промывают холодным метанолом. Метанольный раствор концентрируют в вакууме досуха, остаток растворяют в хлористом метилене (40 г/л) и пропускают через колонку, заполненную активированным углем (1 л угля на 50 r загрузки), элюат концентрируют досуха, ост аток смеши вают с метанолом, охлаждают сухим льдом в течение 15 мин до

-10 С, застывшее масло отфильтронывают, фильтрат концентрируют в вакууме досуха и получают масло, Это масло растворяют в минимальном количестве хлористого метилена, смешивают с силикагелем, упаривают досуха и загружают в колонку с су-, хим силикагелем. Элюируют сначала

10%-ным, а затем 203-ным раствором этилацетата в бензоле, колонке дают стечь, делят ее на 10 равных частей (включая загрузку) образцы насадки рают при R1 0 OS 0 15 0

О, 35 и т,д, по длине всей колонки и элюируют подходящим объемом смеси этилацетат — хлористый метилен-метанол (3:2:1) . В местах, где полосы антибиотика накладываются, отбор производят через каждую 1/8 к . Наличие антибиотика устанавливают по данным TCX и по обугливанию в присутствии серной кислоты.

Образцы Rg0,11-0,35 вырезают из колонки и взмучивают в смеси этилацетат -хлористый метилен-метанол (2:2:1 по объему), фильтруют, промывают смесью Растворителей и концентрируют в вакууме досуха. Остаток растворяют в тре--бутаноле, фильтруют, лиофилизируют и получают пушистое .твердое вещество, Нижнюю фазу системы н-гептанэтилацетат-метанол-вода (3000:1500:

:75:37 по объему) смешивают с диатомовитовой землей (Hа 800 r земли б00 мл Фазы), загружают в колонну (диаметр 7,5 см) смесь 40 г диатрмитовой землей (на 800 г земли

600 мл фазы), загружают в колонку и элюируют верхней фазой укаэанной системы, отбирая фракции по 25 мл, Наличие антибиотика во фракциях определяют методом TCX в системе хлороформ-зтилацетат и по обугливанию.

Фракции 90-150 объединяют, концентрируют и получают антибиотик

В1, 5086,, Пример 1. Стерильную среду содержащую, r:

Соевая мука 1,0

Глюкоза 2,0

Кукурузный настой 0 5

Карбонат кальция 0,3

Вода До 100 мл заражают смытыми или соскобленными с косого агара спорами

ЯС.Ър-овсор сов, Применяют .две .

500-мл колбы, содержащие по 100 мг указанной среды. Колбы интенсивно взбалтывают 72 ч при 28 С.

Полученный материал из 500-мл колбы переводят в бутыль, содержащ ю 12 л той же среды,и ферментируют 48 ч при 28 С и аэрации, Затем пересевают в ферментер, содержащий 300 л той же стерильнойсреды, и перемешивают (173 об/мин) при аэрации (1 л воздуха на 1 л среды в 1 мин) в течение 48 ч при

28 С„ поддерживая РН 6,9-7,0.

Пример 2. Среду, содержащую, г:.

Кукурузный настой 0,5

Соевая мука 1,0

Крахмал кукурузный 4,0

Карбонат кальция Ot j

Вода ;До 100 мл стерилизуют при 120 C и РН 6,4-6,5 в течение 60 мин. 3000 л среды засевают 300 л материала, полученного в примере 1, ферментируют при 2830 С, аэрации (0,6 л воздуха на 1л среды в 1 мин) и перемешивании (150 об/мин) в присутствии 4 л антивспенивателя в течение 138,5 ч в 4000-л Ферментере, Пример 3, 2550 л (рН 7,4) массы после ферментации, полученной, как в примере 2, и 1275 л этилацетата перемешивают 2,5 ч. Добавляют 8Ъ диатомнтовой землй, фильтруют несколькими порциями на паре рамных фильтрпрессов, Фильтрату (3250 л) дают отстояться и отделяют этилацетатный слой (1000 л) . После фильтрования каждой порции жмых промывают н фильтрпрессе этилацетатом. Промывки объединяют, дают им отстояться и отделяют этилацетатный слой (535 л) „

Эгилацетатные слои концентрируют сначала до ?25 л, затем до 20 л.Эти

20 л концентрируют в стеклянном дистилляционном аппарате до получения сиропа.

Сироп выдерживают 48 ч при 4 С, перемешивают с двойным объемом гептана и оставляют на ночь при 4 С, Верхний слой отделяют декантацией и концентрируют до получения смолистого остатка.

К смолистоМу остатку добавляют

10 л метанола, охлаждают сухим льдом несколько часов, фильтруют через спеченное стекло, покрытое диатомитовой землей, и промывают холодным метанолом. Объединенные фильтраты и промывки концентрируют досуха в вакууме и получают 1353,6 r остатка.

715034

1353„6 r остатка растворяют в хлористом метилене (40 г/л) и пропускают через колонку, заполненную

27,07 зернистого угля (?О х 40 меш), со скоростью 375-400 мл/мин. Элюат концентрируют досуха, остаток . (1053 г) тщательно смешивают с 89 л Me анола, охлаждают до - 1 О С хим льдам и выдерживают 15 мин при

-10 С. Застыншее масло отФильтровынают, фильтрат концентрируют досуха и получают 781,4 г масла, 200 г масла растноряют в минимальном количестве хлористого метилена, добавляют 300 r,ñèëèêàråëë, тщательно перемешивают, упаринают н накууме досуха и, загружают в пластмассовую колонку, заполненную 4 кг силикагеля, сверху кладут немного морского песка для прЕдупреждения нарушения слоя во эредия элюиронания.

Элюнруют 12 л 10Ú-ного раствора этилацетата н бензоле, колонке дают стечь и злюируют 7,6 л 20%-ного раствора этилацетата н бензоле, Отбирают фракции, дают колонке стечь, и продувают азотом.Для определенйя антибиотической àKTHBHocYH фракции используют 51гер1ососсиэ р адепез.

Колонку делят на 10 равных частей (нключая загрузку) . Образцы насадки отбирают при Му 0,05, 0,15, О „25, 0,35 и т,д, по длине всей колонки, В местах, где полосы антибиотика накладываются, отбор производят через каждую 1/8 ку, Каждый образец злюируют 10 мл смеси этилацетат хлористый метилен-метанол (2:2:1) и по данным ТСХ в системе этилацетатхлороформ (1:1) и по обуглинанию н присутстнни серной кислоты определяют наличие антибиотика, Образцы сR 0 11-0,35 вырезают из колонки и взмучивают в смеси этилацетат-хлористый. метилен-метанол (2:

: 2: 1), фильтруют, промывают этой же смесью растворителей и концентрируют в накууме досуха, Остаток растворяют н трет-бутаноле „лиооилизируют и получают 26,7 г продукта.

600 мп нижней Фазы системы н-гептан-метанол-этилацетат-вода (3000:

1500: 75: 37 по объему) и 800 г промы-. той кислотой диатомнтоной земли смешивают, загружают в стеклянную ко лонку смесь, состояшую из 40 г диатомитоной земли, 30 мл нижней Фазы укаэанной системы и 13,8 г лиофилизированного продукта, злюируют верхней фазой указанной системы растворителей и собирают фракции по

25 мл, которые анализируют методом

ТСХ. Фракции 90-150 объединяют и получают 2, 75 г антибиотика В1. 508а н виде натриевой соли, Пример 4„ 600 мл нижней фазы системы гептанметанолэтилацетат-вода (3000:1500 80:40 по объему) и 800 г диатомитовой земли.

В колонку загружают смесь 28 r диатомитоной земли, 21 мл указанной нижней фазы, 10,9 г антибиотика

ВЬ508Ь н ниде натриевой соли, элюируют верхней Фазой указанной системы, отбирая фракции по 90 мл. По данным ТСХ на пластинках Силплейт

Г = 22 н системе этилацетат-хлороформ и па обуглинанию судят о наличии антибиртика, Фракции 29-39 объединяют, концентрируют, твердый. .остаток растворяют в трет-бутаноле, лнофнлизируют и получают 4,79 г продукта, 800 мг лиофилизиронанного продукта перемешивают с 300 мл смеси водазфнр-петролейный эФир (2: 1: 1), При перемешивании добавляют 1 н. соляную кислоту до рН 2,5. Органическую фазу отделяют и три раза пропивают равными объемами воды, концентриру20 ют н вакууме, остаток растворяют в трет-бутаноле, лиоФилиэируют и получают 657 мг антибиотика R4508g н ниде свободной кнслоты, 1.с 3 25

= +21 + 1 (c = 0,9, метанол), Найдено%.: С 61,1» Н 8 9; зола О. йК-спектр, мкм: 2,95; 5,88;

8,35; 8,60; 9,00; 9,12; 3,43; 9,62;

10,05 и 10,47, Пример 5, 1 r антибиотика

3() В(,508Ь н виде свободной кислоты растворяют в 300 мл смеси эфир-петролейный эфир (1:1), добанляют к

200 мл воды, при перемешивании добавляют 0,1 н. соляную кислоту до рН 10,0, органическую фазу отделяют, концентрируют и вакууме,,остаток растворяют в 10 мл эфира, добавляют

20 мл петролейного эфира (30-70 С) и кристаллик натриевой соли антибиотика Bl. 508а, выдерживают при 4 С, 40 кристаллы промывают холодным петролейным эфиром, сушат на воздухе и получают 323 мг натриевой соли антибиотик BL 508ь, т,пл. 157-161 С; АЗ Я =+б l (с = 1 52, метанол), 45 Йайдено,%: С 60,99; Н 8,47;

Na 1,95, ИК-спектр, мкм: 6,27; ; 9,0;

9,13; 9,48 и 10,60, Пример б, 1 г антибиотика

5() BL 508 Ь в виде натриевой соли, 834 мг п-бромфенацилбромида, 600 мг карбоната лития и 20 мп сухого диметилформамида выдерживают 16 ч при

37 C добавляют 4-кратный объем хлороформа, фильтруют, фильтрат концентрируют в вакууме и получают сиропоподобный остаток. 90 мп нижней фазы системы гептан-этилацетат-метанол-вода (200:25:1000:17) смешивают со 120 r диатомитовой земли, В колонку загружают сиропоподобный остаток, 12 г диатомитовой земпи и 9 мл нижней фазы указанной системы, элюируют верхней фазой, отбирая Фракции по 10 мл. Активность фракций опреде6з ляют методом ТСХ. Фракции 22-41

715034

Формула н з обретения

Н око „

Н

СНН

СНА .П

Н0

Н "С « К ! . ео н отличающийся тем, что штамм. БЬ"ер 1оьтчсеэ (i>g ascop(сus.

8180 вырацивают в аэробных условиях в жидкой: питательной среде, содерСоставитель С. Малютина

Ре акто Т (1)а ганова Тех е О.Андрейко Хо екто я. Веселовская

Эаказ 9327/63 Тираж 522

ПНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра ская наб.

Подписное

4 5

Филиал ППП Патент, r Ужгород, ул. Проектная, 4. объединяют и концентрируют в вакууме, остаток растворяют в 50 мл метанола и фильтруют. Фильтрат нагревают на паровой бане, добавляют 10 мл воды и дают медленно охладиться до о

4 С. Получают 566 мг кристаллов бромфенацилового эфира антибиотика

BI 508Ь,(%3Д=+63 + 2О (с 51, хлороформ) .

Найдено,Ъ: С 58,80; Н 7,80;

Br 8,64, ИК-спектр, мкм: ?» 5,88; 6,30; 8,20;8,45z8,60; 9,00; 9,15 (широкая), 9,37 (широкая) 9,62; 10,06 и 10<37.

Молекул ярн:::Й не i!Олог! . .>>ð - .т с и—

-бромфенациловоro =:фир;- В!. 508а, определенный дифракц ей ре т пановских пу:ей, pai= ен 1114 " .- 0, 384 „

Предлагаемый способ позволяет получить антибиотик R L 508ь, обладающий высокой активность." против кокковых инфекций теплокровных жи

Боткых н невысозсой оксич31остью 4

Способ получения антибиотика формулы

36 ж=.-. - и жашей источники углерода, азота и мин ер ал ьн ые с оли, с последуюшим выделением целевого продукта,