Способ получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью
Патент 716524
Авторы
Классы МПК
Способ получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью
Иллюстрации
Реферат
Сфюэ Советскнк
Сфцналнстнческнк
Республнк
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ (6I} Дополнительный к патенту (22) Заявлено 180477(21) 2474802/30-15 (23) Приоритет — (32) 19.0476
< >716524 (51) М. Кл.
С 12 1) 9/14
С 12 Э 13/00
Государственный комитет
СССР ио делам изобретений н открытий (33) США (3) ) 678328 (5З) УДК 576.8 (088. 8) Опубликовано 150280 Бюллетень ¹ 6
Дата опубликования описания 180280
Иностранцы
Георг Алберс-Шонберг (Швейцария)>
Ричард Уильям Бэрг, Томас Уильям Миллер
Ормонд и ХимаН Воллик (США) (72) Авторы изобретения
Иностранная фирма Мерк Энд Ко, Инк (США) Pl) Заявитель (5 4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ОБЛАДАЮ<цИХ
АНТИПАРАЗИТАРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Изобретение относится к способу втолучения веществ, обладающих актипаразитарной активностью, микробиологическим путем.
В литературе не описаны способы получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью, путем мик-. робиологического синтеза. Согласно изобретению способ получения подобных веществ характеризуется тем, что штамм SE, eptornq Сев с(чЕтттзтt.(8 s (ц р 8165 (ATTC
31267) выращивают на питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли в аэробных условиях а последуют им выделением из среды выращивания целевого продукта. Выращин ание ук аз а нного штамма проводят при температуре 20-40 С, pH среды 6,0-7,5 в течение 1-8 дней на среде, содержащей 0,5-5Ъ источников углерода и 0,2-6% источников азота. Целевой продукт выделяют фильтронанием среды выращивания зкстрагиронанием образовавшегося на фильтре остатка — мицелия смешинающимися с водой органическими растворителями и затем зкстрагиронавием остатка не смешивающимся с но1дой органическим растворителем.
Вещества, описываемйе здесь под общим названием С-076, получают выращиванием в контролируемых условиях ранее не описанных штампов микроорганизмов Streptornices avermitieis, которые насчитывают до восьми различных родственных соединений, описыавемтх здесь под названием
С-076 Ala, Ala, A2a, А2в, B)a, Вlн, 82а В2а. Все эти соединения обладают значительной антипараэитической активностью и могут быть получены ферментацией и извлечены почти в чистом виде.
По данным таксономических исследонанит= микроорганизм способны образовывать С-076-соединения, которые являются новым аидом рода treptomvces названного. Streptomvces avermitifis
Такая. культура, выделенная иэ почвы, н коллекции культур Марка и К Ин1<.
Роуй, Нью Джерси, была обозначеяа как МА-4680. Образец культуры, Поющий С-076, был депонир<зван н постоянной коллекции культур Отпела ферментации исследовательского ялиала
Департамента сельского хозяйства
США н Претории и получил цорялк 1н.»й
716524 номер NRRZ 8165. Образец NRRZ 8165 был также депонирован в постоянной коллекции Американской коллекции типовых культур в 123б1 Парклаун
Драйв Мериленд 20852 и получил порядковый номер ATCC 31, 267.
Морфологические и культуральние характеристики следуюшие. Морфология: спорофоры образуют спирали в виде боковых ветвей воздушного мицелия.
Спирали компактные, но делаются более откритыми по мере старения культуры. Споры - цепочками не более чем в 15 спор, обычно имеют сферическую или овальную форму (при увеличении в 970 раз). Спорообразование наблюдается в araoe с овсяной му кой, с глицерином- аспарагином, с солями, крахмалом и с яичным альбумином, Поверхность спор гладкая.
Агар с овсяной мукой: обратная сторона — темно-коричневая. Воздушный мицелий: порошковый коричневатo-серый (41i)"",(обоз.начения»" номера цвета взяти из
Condor Barman Humean, 1%6, 4-th СЖ10т
CWteiner ot America, Chicago, Э0. смешанный с белым.
Растворимый пигмент: коричневый
Яапек Докс агар (сахароза-нитрат) .
Вегетативный рост: плохой, бесцветный.
Воздушный мицелийг скудный, серов атый .
Растворимый пигмент: сероватокоричневый светлого тона.
Яично-альбуминный агар: вегетативный рост умеренный, светло-серовато-желтовато-коричневый (В ge), смешанный с белым, Растворимый пигмент: светло-серов ато-коричневый .
Глицерино-аспарагиновый агар, веге-. . тативный рост: обратная сторона желтовато-коричневая, Воздушный мицелий: порошковый коричневато-серый (41i), смешанный с белым.
Растворимый пигмент: светлый, желтовато-коричневый.
Неорганические соли — крахмал.
Вегетативный рост: обратная сторона серовато-желтовато-коричневая.
Воздушный мицелий: порошковый, светлый, коричневато-серый (41i)"", по краям более темно-коричневатосерый (41i )»".
Растворимый пигмент: светложелтовато-коричневый .
Агар с дрожжевым экстрактом-декстровой-соли.
Вегетативний рост: обратная сторона темно-коричневая.
Воздушный мицелий: умеренный, коричневато-белый.
Растворимый пи гмент: коричневый, Агар с пентоно-железо-дрожжевым экстрактом, Вегетативный рост: темно-коричневый.
Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: от темнокоричневого до черного, Миланин: положительная реакция.
Выделение Н S; положительная рей (p акция.
Агар с дрожжевым экстрактом мальтэкстрактом.
Вегетативный рост: обратная сторона темно-коричневая.
Воздушный мицелий: умеренный, коричневато-белый.
Растворимый пигмент: коричневый.
Питательный агар.
Вегетативный рост: коричневый.
Воздушный мицелий: скудный, сероватый.
Растворимый пигмент: светло-коричневый, Питательный крахмальный агар. .
Вегетативный рост: коричневый.
25 Воздушный мицелий: скудный, серовато-белый.
Растворимый пигмент-: светло-коричневый.
ЗО Гидролиз крахмала: хороший.
Картофельная масса.
Вегетативный рост: коричневый, Воздушный мицелий: коричневый, смешанный с серовато-белым.
35 Сыворотка крови Лефлера.
Вегетативный рост: сероватокоричневый.
Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: некторое потемнение среди.
Разжижение: нет.
Питательный тирозиновый агар.
Вегетативный рост:. обратная сторона от темно-коричневой до черной.
Воздушный мицелий: скудный, сероватый.
Растворимый пигмент: темно-коричневый.
Разложение тирознна: нет. усвоение углерода.
Основная среда Придгема Готтлиба
1 1Ъ источника углерода + (+
= рост, - = нет роста, в сравнении с контрольной без источника углерода) .
Глюкоза + маннитон +
Арабиноза + манноза +
Пеллюлоза — ФаАиноза +
Фруктоза + рамноза +
Лактоза + сахароза + бО Мальтоэа + ксилоза +
Иноэитол +
Питательный желатиновий агар.
Вегетативный рост: коричневый.
Воздуиный мицелий: скудный, б5 серовато-белый.
716524
Растворимый пигмент: светло-коричневый.
Разжижение желатины: хорошее.
Желатина (посев уколом).
Вегетативный рост: коричневое кольцо ° 5
Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: зеленоватокоричневый.
Разжижение желатины: полное. агар-снятое молоко.
10 . Вегетативный рост: темно-коричневый, Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: темно-коричневый, Гидролиз казеина: хороший.
Лакмусовое молоко, Вегетативный рост: темно-коричневое кольцо роста.
Воздушный мицелий: нет.
Цвет — темно-коричневый.
Коагуляция и/или пептонизация: полная, делается щелочной (рН 8,1).
Снятое молоко.
Вегетативный рост: темно-коричне- . вое кольцо роста. 25
Воздушный мицелий: нет.
Растворимый пигмент: темно-коричневый.
Коагуляция и/или пептонизация: полная пептонизация, делается щелоч- у() ным (рН 8).
Температура: (агар с дрожжевым экстрактом + соли):
28 С вЂ” хороший вегетативный рост и воздушный мицелир, 35
3 7 С вЂ” хор оши и ве гет ати вный ро ст
;и воздушный мицелий, 50 С вЂ” роста нет.
Потребность в кислороде: (культура уколом в агаре с. дрожжевым экстрактом + соли).
Аэробная культура.
Все определения производились через три недели при 28 С, если
Не оговорено иначе. Значения рН всех сред почти нейтральные (6,8-7,2) .45
При тщательном сравнении этих. данных с опубликованными описаниями, включая Руководство по определенной бактериологии Беркея (8 издание) известных микроорганизмов, обнару- 5Q живаются значительные различия, указывающие,что данный микроорганизм. должен бить классифицирован как новый вид, На этом основании он был назван 51гер1от сеэ очегmitit)i s . S5
С-О 76-соединения получают при фермент апии подходящей водной питательной среди штаммом Streptomvces averrniti(is в описываемых далее условиях: водные среди, применяемые для получения многих антибиотиков, являются также пригодными для данного процесса получения С-076-соединений.
Такие питательние среды содержат чсточни ки j глерода и азот а, ассимилируемые микрооргачизмами и неболь20,0
15,0 10, 0
4,0
0,5
2,5
0 1
0,01
0,01
Кукурузная мука, г
Соевая мука, r
Барда, г
Цитр ат натри я, r
СаС3 .2Н О, r
Полигликоль P 2000, мл
М СО4 ° 7Н О, r
СаС1 6Н О, г
FeSO< ° 7Н О, г
Дистиллированная вода, мл рН 6, 1000
Среда В
Р аст воримий кр а ямал, г
I .èäêoñTü от замп ки кукурузы, г
Перелоза, г
20,0
15,0
>,О шие количества неорганических солей.l
Г
Кроме того, ферментационные среды могут содержать следи металлов, необходимых для роста микроорганизма. Они обычно присутствуют в виде комплексных соединений источников углерода и азота, применяеых в качестве источника питания, но их мож)to добавлять к среде отдельно.
Такие углеводы как сахар, например декстроза, сахароза, мальтоза, лактоза, декстран, церелоза, и т.п. и крахмалы являются хорошими источниками ассимилируемого микроорганизмами углерода в питательных средах.
Количество источника углерода, применяемого в среде, частично зависит оТ количеств других компонентов среды и обычно составляет 0,5-5вес.% от количества среды и считается достаточным. Источники углерода можно применять отдельно,или их можно комбинировать в среды с другими компонентами, При образовании С-076-соединений легко ассимилируемых штаммом Streptornvces averrnitifis применяют такие различные источники азота, как дрожжевые гидролизаты, дрожжевые автоли- заты, соевая мука, гидролизаты казеина, дрожжевые экстракты, жйдкости для замочки кукурузы, кукурузная барда, мука хлопковых семян, мясные экстракты и т.п. Можно применять или один источник, азота, или в комбинации с другими соединениями в количестве 0,2-6 вес.% среды.
Из питательных неорганических
O солей, которые можно вводить в культуральные среды, можно назвать обычные сони, способные давать ионЫ Натрия, калия, магния, аммония, кальция, фосфата, сульфата, хлорида, карбоната и т.п. Вводятся в поеду также следы таких металлов, как кобальт, марганец, железо и т.п. Далее приведены примеры сред, пригопных пля выраь1ивания штаммов 5treptoittvces aver пъ66з с целью получения Г-076 соединений
Среда А.
716524
Соевая мука, г (ИИ)SO, г
Кукурузная мука, r
Соевое масло, мл
КН РО4, г
Дистйллированна я вода, мл рН 6,7
4,0
4,0
1, 0
2,5
0,3
6,0
1000
Среда С
Томатная паста, r
Овсяная мука, г
Дистиллированная вода, мл рН 6,0. 40,0
15,0
1000
Среда
Овсяная мука, г
Томатная паста, г
Дистиллированная вода, мл рН 5,5
20., 0
20,0
1000
Среда Е
Декстроз а, r
Пептон (фирьи ДИАко
Лабор атори з Детройт ), г
Дрожжевой автолиэат, г (Ардамин оН Анимы
Ист Продактс Инк, П ат ерсон )
НаСМ, г
КС3, r
FeSO4 (1 Н ), 8О„6Н2О, MgC3 - 6 Н О, г
СаС2а 2 H*O, г
Дистиллированная вода, мл рН 7,4
10,0
5 0
3,0
12 7
О, /2
0,035
5,32
0,73
1000
60 Ферментацию с применением микроорганизмов, образующих С-076-соединения,можно проводить при 20-40 С.
Для получения -оптимальных результатов наиболее целесообразно проводить эти ферментации при температурах
24-30 С. Наиболее предпочтительны температуры 27-28ОC. рН питательной среды, пригодной для получения С-076 соединений, можно менять в пределах 45
5,0-9,0 предпочтительно 6,0-7,5.
Ферментации в небольших количествах удобно проводить в колбе в стерильных условиях, заражая питательную среду спорами или вегетатив- 50 ними клетками штамма St ornvces aver-, mitipis образующего С-076 — соединения
Колбу затыкают ватой и выдерживают при постоян ной температуре 2 8 С и вэбалтывании в течение 3-10 дней. 55
При работе с большими количествами ферментацию рекомендуется пооводить в сосуде, снабженном мешалкой и устройством для аэрирования питательной средь1. Питательную среду готовят в сосуде, стерилизуют и затем заряжают источником вегетативного клеточного материала штамма Streptomvces averritiQis образую его С-076соединения. Ферментацню продолжают
1-8 дней при перемешивачии и/или аэрировании питательной среды при температуре 24-37 С, скорости перемешивания95-125 об/мин и при подаче воздуха 1,8-18 м1/мин.
Получаемые lto изобретению новые вещества, называемые здесь С-076веществами, находятся r;,o окончании ферментации главным образом в мицелии и могут быть извлечены и отделены, как описано выше. Выделяют четыре главных и четыре второстепенных компонента C-07б-соединениг, образуемых
Ягефотусеэ averrriНбв . Идентифицировано восемь различных соединений С-076, Ala, Аlв, А2а, А2в, Вlа, В1в, 82а В2в, Главные компоненты обозначены )буквой а, второстепенные буквой в . Структурные различия между соединениями а и в должны быть одинаковыми для каждой из четырех пар, Как и следовало ожидать, даже главные С-076-соединения не образуются в одинаковых количествах при описанных здесь условиях ферментации. Так, Al соединения составляют
20-30 вес.% от общего количества получающегося комплекса С-076, соединения А2 составляют 1-20 вес.%., соединения Bl и В2 каждое 25-35%. Весовое соотношение ряда соединений а к ряду соединений в равно
85-15 - 99:1.
Отделение соединений С-076 от всей Ферментационной массы и извлечение индивидуальных компонентов . производится экстракцией растворителем и хроматограйнческим фракционированием различными хроматографическими методами и с различными системами растворителей.
С-076-соединения слабо растворяются в воде и хорошо в органических растворителях. Это свойство используют для извлечения их из ферментационной среды. Так, по одному способу извлечения всю ферментацион. ную массу отфильтровывают и водный фильтрат выбрасывают. Затем отжатый влажный фильтровальный остаток мицелия экстрагируют подходящим растворителем. Хотя и можно применять любой органический растворитель, лучше применять растворитель, смешивающийся с водой, например ацетон, метанол, этанол и т.д. Для достижения макси.мального извлечения рекомендуется многократная зкстракция. Растворителем извлекаются активные компоненты
С-076, а также вещества, не обладающие антипаразитической активностью соединения С-076.
Если растворитель смешивается с водой, то воду также удаляют из влажного мицелия.Экстрагированный мицелий можно отбросить. Экстракты упарнваот для удаления органического растворителя и экстракцию повторяют несколько раз с другим растворителем. Если
716524
А1в А2а
А2в
1 . >o
+38, 3 "+2
+55,7 i2
+68,5 т2
+48,8 +2
Оптическое вращение (С=0,87) (С =1, 06) (С =1,64) Иолекулярная масса (определена масс-спект.— рометрически) 858 890
876
872
872 904
890
886 Ультрафиоле- 237 товый спектр (28;700.
4, 458) 237 (29; 120;
4, 464) 237 (27;580;
4, 441) 237 (28:800;
4,459) 243 (31, 850;
4, 503) 243 (30,590;
4, 486) 243 (31 740,"
4, 501) 243 икр аах °
243 (31,275;
4, 495) 252 (20,5101
4, 431) 252 (20,060;
4, 302) 252 (20, 425;
4, 310) 252 (20.290;
4,307) примеси соединений ряда в. Ряды а и в различаются только числом д
-СН в. низкоалкильном заместителе и эта
60 азница не связана с хромофором. ультрафиолетовое поглошен разница ние в первую очередь характеризует степень и природу ненасышенности в слединеОптические вращения определяют, нии. о и поля именяя стандартные методы и
Ультрафиолетовые спектральные данные были получены с помощью ульфиолетового спектрометра Кери, ах в модель 15 в метанольных р аствоюах кварцевых ячейках, плошадью 1 см
Мотя ультрафиолетовое поглощение представлено как поглощение ряда по глошеа, фактически оно является по нием соединений ряда а, д р сп ер>кащих при первой экстракции применяют с г=1 шивающийся с водой растворитель, то при второй экстракции предпочтительнее применять не смешивающийся с водой растворитель, например хлороформ, хлористый метилен, четыреххлористый углерод, этилацетат, метилэтилкетон, метилизобутилкетон и т.п. Полученные экстракты высушивают и концентрируют обычными методами ° Получают остатки, содержащие
C-076-соединения с примесями других соединений. Затем эту фракцию хроматографируют для отделения активных. С-076-соединений от прочего материала и также для выделения индивидуальчых С-076-соадинений. хроматографируют на колонке с применением таких сред, как силикагель, окись алюминия, гели декстрана и т.п. и элюирование производят или различными растворителями и/или 20 комбинацией двух или более раствори телей, взятых в различных соотно шениях. жидкостную хроматографию применяют для открытия С-076-соединений и жидкостную хроматографию высокого давления можно применять для выделе ния очищенных фракций, содержащих одно или более соединении. Аналогично храматографию в тонком слое можно применять для обнаружения и выделения индивидуальных С-076-соединени . Присутствие активных С-076-соединений определяется испытанием различных хроматографических фракций на антипаразитическую активность и также спектральными характеристиками этих соединений, Спектральные и другие физико-химические характеристики индивидуальных С-076-соединений приведены в табл.1, Эти соединения хорошо растворимы в больщинстве обычных органических растворителей и обладают минимальной растворимостью в воде. 1" а б л и ц а !
716524
Таблица 2
Ala(0,6 мл 16%) 15,1
27,5
20,3
13,0
19,9
18,4
12,0
16,4
17,7 (ЗС) 35,2
39,7
56,4
45,7
40,5
34,3
30,6
36,6
67 3 68 2
76,1
74,9 (2С) 57,7 (2С) 69,4 (2С)
77,0
95,0
78,3 . 79,4
95,8
82,0 (2С) 80,6
77,5
119,7 124,9
135,2 136,0 (2С) 118 4
98,5
127,8
136, 0
139,9, 173, 8
136, 6
136, 1
A2g(0,6 мл 16%) 13, 8.
15,1
35,8
11 8
27,3
20,3
18,4
19,9
17,7
12,4
40,8 41,2
45,7
39,8
36,5
35,3 (ЗС) 34,3
68,2
67,3, 67,7
70,8
69,9 (ЗС) 57,7 ) (2С) 56 4
79,4
94,9
81,8
80,6 (2С) 78) 3
77,6
77,0
76 1
118,4 119,7
136,6
124, 9 135, 7
117,7
173,7
99,7
97, б.
137,6
140,0
B1a(0, 3 мт.„16%) 12i0
27,5
20,2
19,9
18,4, 17,7
16,4
15, 1
12,9
56, 4(ZC)
78,3
118к 1
45,7
40,5
39, 8.
36,6
35,2
30,6
34,3 (ЗС)
68, 62 (2С) 76, 1.
75,0
95, 8. (2С) 68,4
67,8
67,3
98,5
95,0
82,0 (2С) 80,5 (2С) 79,4 (2С) 136, 2 137,9, 127,9 135,2, 124,8
120, 4
173,6
118, 4, 1.39, 7, В2в (О, б мл 16%) 20,2 27, 3
18, 4; 19,9
12,4
1ь,б риметр,еАсса. Фактор концентрации (с) дается как количество соединения в данном растворителе, выраженное в процентах..
Данные ЯМР-спектра 13С для С-076
Ala, A2a:В la и В2в приведены в табл. 2.
Спектры получены с помоцью спектрометра ядерного магнитного резонанса.
Вариант модели CET-20 в дейтерированном хлороформном растворителе при
13,8 15,1 . 17,7 применении тетраметилснлана в каче"тв- внутреннего стандарта, Обьем раствора и концентрации образцов указаны в кажцоч случае с последующими химическими сдвигами относительно тетраметилсилана для каждого соединения, данными в частях на миллион.
Химические сдвиги даются для отдельного атома углерода, если не оговорено иначе, в скобках после химического сдр ига, 716524
13
Продолжeние . табл, 2
62 (0,6 мл 16Ъ)
35,2
35,8 36,5
45,8
41,2
40,8, 39,8
68,3 (ЗС) 34,4
67, 3 67,7 (2СО) 70,9
69,9 (3С) 56,4 (2С) 98,6
94,9
81,8 (2С) (2С) 80, 5
120, 4 124, 8
79, 4.
73,3, 117,7, 173,5
76,1
99,7, (2С) 135,7 . )38,0
118,0
139, 8
Н0
30 и где пунктирная линия указывает простую или двойную связь; R — окси35 группа, которая присутствует только тогда, котда пунктирная линия указывает на простую связь, R — бутил или пропил и R -метокси- или оксиз группа, CH
-ССН, С Н3
-ОС Н, -ОСН1
Бу ил
Двойная связь
Двойная связь
А1а
А lв
-OH
А2а
-ОН
А2в
--ОН
Двойная связь
Двойная связь
Bla
-OH
B la
-ОН
В2а
-ОН
-ОН
В2в
Характеристики масс- спектральныХ пиков восьми С-076-соединений приво,— дятся в табл.3, В первой строке таб- 20 лицы представлено отношение массы к заряду. (м/е) молекулярного иона каждого соответствующего соединения и остальные циАры дают отношение массы: к заряду главных фрагментов каждого соединения. Отношения масс к заряду находяшихся в одном горизонтальном ряду, указывают аналогичные фрагмен.,ты каждого соединения. ,Основываясь на экспериментальных данных, исследованиях и измерениях, :описанных здесь, считается, что
С-076-соединения должны иметь следуюшую структурную формулу: Ri где R- P - ) -олендроз ил- f -1-олеандрозид структуры
Индивидуальные соединения, входяшие в эту структурную Формулу поиводятся ниже:
Пропил
Бутил
Пропил
Бутил
Пропил
Бутил
Пропил
716524
lá
Новые соединения>полученные по изобретению, имеют значительную паразитицидную активность, как антигельминты, инсектициды и акарициды, у(ля животных и в сельском хозяйстве, Как готовые препараты эти соединения можно назначить внутрь, например в виде капсуль, больших пилюль или таблеток в виде жидких обильных доз антигельминтов для млекопитающих, Такие .отдельные дозы могут широко изменяться по общему весу и содержанию антипаразитического агента в зависимости от таких факторов, как паразит, подлежащий уничтожению, силы и типа инфекции и веса тела животного, Применять предлагаемые соединения можно или как очищенные индивидуальные С-076-компоненты, или в виде примесей двух или трех индивидуальных компонентов, поэтому нет необходимости тщательно разделять различные
С-076-соединения, полученные после очистки ферментационной среды, Обычно для предупреждения переносимых паразитами забОлеваний приМеняЮт смесь, содержащую два или более
С-076-соединений, но без примесей других соединений. Такая смесьобычно содержит C-076-соединения в произвольных соотношениях, но все они обладают значительной активностью. Антипаразитическая активность может быть точно определена. В частности, необяз тельно отделять компоненты в от родственного компонента в . Такие соединения отличаются только длиной 25-ой боковой цепи. Разделение таких родственных соединений обычно не производится, так как соединение в присутствует лишь в виде примеси.
С-076-соединения при добавлении к корму животных можно использовать в виде жмыхов мицелия Аерментацион25
55 бО
Соедин ени я, в ксторнх R 1 — бутил (соединения ряда а ) и соответствующие соединения, в которых B — пропил (соединения ряда в ) ведут себя одинаково в большинстве процессов извлечения, например при экстракции растворителем. В каждой паре соединений а и в соединение а находится в больщем количестве и обычно составляет 85-993 смеси соединений t|y и в . Присутствие пропиловых соединений подтверждается
- 10 ,масс-спектрами соединений, где пики представляют собой Фрагменты, содержащие бутильную группу, имеют парные пики с массой на 14 единиц (или одну
-СН ) меньше. В дополнение следует отметить, что для отделения компонентов Вlв от компонентов Ala применяли жидкостную хроматогграйию высокого давления и масс-спектр такого Аlв-соединения подтверждался масс-спектромет-20 рией высокого разрешения (см.табл.3) ной среды. Поскольку мицелий достаточно активный и уров ен ь акти вности мицелия можно определить, его можно добавлять непосредственно к корму животных °
Пример l.
Среда 1
Томатная паста 20 г/л
Дрожжи 10 г/л
Крахмал модифицированный, 20 г/л
СоСЙ - 6Н О
Полигликоль 2000
Дистиллированная вода рН 7,2-7,4
5 г/л
О, 321 мл/л
Дост аточное количество
Стадия A, .
50 мл среды 1, помещенной в колбу
Эрленмайера емкостью 250 мп, инокулируют з амороженной ампулой 5treptomvсез ove .ттнН6 МА 46 80, Колбу инкубируют при 28 С при вращении взбалтывателя со скоростью 160 об/мин по кругу диаметром 50 мм в течение 24 ч.
Стадия В.
500 мл среды 1, содержащейся в двухлитровой колбе Эрленмайера, инокулируют 10 мл содержимого колбы стадии А. Среду инкубируют при 28 С
IIpH вращении вэбалтывателя co скоросстью 150 об/мин по кругу диаметром
50 мм в течение 24 ч, Стадия С.
В бродильный чан иэ нержавеющей стали емкостью 189 л заливают 160 л среды 2 и добавляют 500 мп посевного материала, полученного на стадии В. о
Чан инкубируют при 28 С при вращающейся со скоростью 150 об/мин мешалке в течение 24 и скоростью аэрирования 2,7 м /мин.
Среда 2.
Декстроз а, г/л 1
Крахмал кукурузный, 10 г/л
Мясной экстракт, г/л 3 . Автолизированные др ожж и, г/л
NgSO . 7Н О, г/л, О, 05
Ma HPO, г/л 0, 10
К,РО, r/ë О, 182
Сасо, г/л 0,5
Дистиллированная До ст ат очное вода рН 7, 0-7, 2 количество
Стадия Д.
В бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 756 л заливают 457 л среды б и добавляют 43 л материала прививки, полученного по стадии С.
Чан инкубироваЛи при 28 C при перемешивании и скорости вращения мешалки
114 об/мин и аэрировани r при скорости потока воздуха — 9 м /мин.
Стадия 3.
Крахмал продажный, CPC, r
Модифицированный (фирмы CPC Корп, г 40,0
Барда, r 7,0
17
1.8
716524
Автолизированные дрожжи (фирмы Ист продактс инк), г
СоС Е< 6Н О, мг
Дис тиллиров ан н ая нода, мл рН 7 3
5,0
1000
Фракцию С-076 Bl хроматограФируют на 2 силикагелевых пластинках (как указано выше) гек саном, содержащим
15Ъ изопропанола и получают 55 мл почти чистого С-076 В1. ЯМР- спектр этого образца приведен в табл.2.
Пример 2. Ферментацию, описанную н примере 1, повторяют дважды и обе среды объединяют. Ферментационную среду обрабатывают так, как описано н примере 2, полу ая 3, 3 л первоначального хлороАормпого экстракта, который содержит 60 мг/л всех твердых веществ и по данным хро ла1 тографии в тонком ело 0, 5Ъ mr- л; нений С-076.
Стадия Е.
По окончании этого всю культуральную среду отфильтровывают и оставшийся на фильтре жмых, содержащий С-076 ,соединения, промывают водой. Затем его взмучивают в 120 л ацетона в течение 30 мин, отфильтровывают и промывают 30 л ацетона. Ацетоновые экстракты объединяют и выпаривают при пониженном давлении до объема 40 л. 15
Разбавленной соляной кислотой рН концентрата доводят до 4,0. Концентрат экстрагируют 3 раза произвольными количествами хлороформа. Хлороформные экстракты высушивают пропускани- Э1 ем через слой инфузорной земли (СаперСел). Объединенные экстракты концентрируют при пониженном давлении до 4 л. Хлороформный концентрат филь.труют и загружают в колонку, заполненную 2,9 кг силикагеля в хлороформе. Колонку элюируют хлороФормом, собирая восемь фракций по 3,5 л каждая. Затем колонку элюируют смесью .хлороформ: метанол-(49:1), собирая еще восемь фракций по 3,5 л (Фракции 9-16). Фракцию 3. упаривают досуха и получают 76 г маслянистого нещества, содержащего главным образом
С-076-соединения.
97Ъ этого продукта растворяют в
685 мл хлористого метилена и хроматографируют на 600 г кремнекислоты, Колонку (диаметр 7,3 мм, длина
36см) проявляют 7,5 л смеси хлористого метилена и бензола (7:3) и затем"О
2,26 л смеси хлористый метилен бенэол-7:3 с добавкой 5Ъ иэопропанола.
Фракция, элюированная смесью хлористо го метилена с бензолом с добавкой 5Ъ изопропанола,имеет четко окрашенную 45 полосу и содержит фактически весь материал С-076, как это было определено хроматографией в тонком слое (см.пример 5). Эту фракцию объемом (500 мл) упаривают и снова хрома- 5() тографируют на 105 r кремнекислоты (диаметр колонки 3,7 см, длина
18 см) в хлористом метилене. Колонку проявляют тремя порциями хлористого метилена по 100 мл, содержащего у
4,10 и 20Ъ эфира. )(альнейшее элюирование хлористым метиленом с содержанием 20Ъ эфира дает 2 окрашенных полосы. Фракция между двумя полосами фактически содержит весь С-076-ма60 териал, как это установлено с помощью хроматогра ни в толк эм слое, Фракцию, содержащую С-076, хроматографируют на 59 г коемнекислоты
;(диаметр колонки 3,7 cv, длина 11 см) в хлористом могилеве. Колонку промывают хлористым метиленом, содержащим
10Ъ эфира, В начале элюирования отбирают фракции по 70 мл и затем отбирают 26 фракций по 5-6 мл. Фракции
3-26 объединяют и получают 1,35 r материала, его анализируют хроматографией в тонком слое (силикагелевые пластинки Аналтак G F 254, проявленные хлористым метиленом, содержащим
5Ъ изопропанола, Веществом, имеющим
Rf 0,28 является С-076 Аl.
Колонку элюируют хлористым метиленом, содержащим 20Ъ эфира (200 мл), затем хлористым метиленом, содержащим 50Ъ эфира (800 мл), Получают небольшое количество смеси С-076 Al и А2 и нсе остальное количество
С-076 А2. Вес С-076 А2 800 мг, При дальнейшем элюировании хлористым метиленом, содержащим 5Ъ изопропанола, получают 135 мг С-076 Bl
Разделение производят по ультрафиолетовому поглощению элюата. С-076 Bl u А2 имеют очень близкие величины и на силикагелевых пластинках хроматограмм в тонком слое (аналтак G F
254) и хлористом метилене с 5Ъ изопропанола. Рднако оба компонента ясно различимы на тех же пластинках, проявленных гексаном, содержавшим
10Ъ изопропанола.
Всю фракцию С-076 А1 наносят на
14 силикагелевых пластйнок (аналтак
СТ 254, 20 х 20 см, толщина 500 мкм) .
Пластинки проявляют гексаном с 10Ъ изопропанола. Полосу, содержащую
С-076 Al удаляют с пластинок, экс- . трагируют эфиром и снова наносят на б пластинок и 5 раз проянляют гексаном, содержащим 5Ъ изопропанола.
-076 Al удаляют с пластинок, снова хроматографируют, проявляют чистым эфиром и получают 270 мг почти чистого С-076 Al ИК- и ЯМп-спектры этого образца приведены в табл.2, Фракцию С-076 А2 хроматограФируют на 10 силикагелевых пластинках (аналтак HF 254), проявляют 5 раз ,гексаном, содержащим 15Ъ изопропано ла и получают 265 мг почти чистого
С-076 А2, ИК- и ЯМР-спектры образца этого вещества приведены в табл.2.
l9
716524
3 л этогс хлороформного раствора хроматографируют на 2400 г силикагеля (Девидсон, сорт 62) н хлороформе.Колонку (.9,5х122 см) проявляют восемью пооциями по 3800 мл хлороформа (фракции 1-3), затем восемью порциями по 3800 мл смеси хлороформ: метанол-49:1 (фракция 9-16) . Индивидуальные фракции анализируют хроматографией в тонком слое (силикагелевые пластинки Кванта/Грамм 01Г), поо- 0 явленные хлороформом: метанолом
=19:1. Каждую из фракций 9-11, 12-13 и 14 выпаривают досуха. и получают
6,63 r твердых веществ, содержащих
С-076А компоненты,но фракциях 9-11
24,9 г твердых веществ, содержащих
С-076В компоненты, но фракциях 2-13 и
4,7 г твердых веществ, содержащих
-076B-компоненты во фракции 14.
Фракции 12-14 объединяют (29,62г), растворяют в 100 мл хлористого мети- 20 лена и хроматографируют на 400 r силикагеля (Девидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонку элюируют
1500 мл смеси хлористый метилен:
2-пропанол-99:1, 1500 мл смеси хло- Я5 ристый метилен: 2-.пропанол-49:1, 2000 мл смеси хлористый метилен:
2-пропанол-19: 1 и 1000 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол-9:1.
2,56 r вещества, выделенного из элюа- () та объемом 5500 мл, и 5,09 r, выделенного из элюста объемом 60006500 мл, растворяют в 25 мл хлористого метилена и хроматографируют на 60 г силикагеля в гексане. Собирают головные фракции из 70 мл гексана и 100 мл смеси гексан: диэтиловый эфир-„4:1 и затем колонку проявляют 600 мл сме си гексан: диэтиловый эфир=l:4, отбирая фракции IIo 20 мл и затем элю- 40 ируя 700 мл эфира и отбирая фракции по 100 мл. Из элюатов объемом 400600 мл получают 1,035 г твердых веществ, содержащих Bl-компоненты
С-076у иэ объемов 600-1000 мл полу- 45 чают 0,881 г твердых веществ, содержащих смесь компонентов Bl,B2= аС-076, и из объемов 1100-1500 мл получают 0,381 г твердых веществ, содержащих В2-компоненты С-076. 5()
Смесь компонентов Bl и В2 затем растворяют н 4,2 мл смеси метанол: вода=4:1 и хроматографируют на Порасиле С18 (Бонданак 37-75 мкм в том же растворителе. Из обратнофазной колонки высокого давления (сначала элюируются более полярные компоненты) размером 1,2 м х 16 мм элюируют вещество со скоростью 800 мл/ч и отбирают фракции по 21, 3 мл, Приcóòñòâèå компонентов С-076 подтверждается наблюдением УФ-поглощения фракций. С-076 В2 несом 137 мг извле-" кают во фракциях 24-37 и С-076 Bl весом 195,4 г но фракциях 51-70. Затем каждый образец отдельно хроматоt графируют на колонках, заполненных 4 г силикагеля (Денидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонки элюируют 35 мл смеси хлористый Ieтилен: метанол=9:l. Последние 20 мл элюата из каждой колонки собирают, выпаривают досуха и получают 155,8 мг
С-076 В2 и 90 мг С-076 Bl.
Затем 50 мл С-076 Bl и 100 мл
С-076 В2 храматографируют на препаратинных силикагеленых пластинках (Аналтак HF 254) извлекают гексаном, содержащим 12% изопропанола с последующим извлечением эфиром и получают почти чистые С-076 Bl и С-076 В2.
Пример 3. 50 мл среды, находящейся в колбе Эрленмэйера емкостью 25 мл, состава, нес.Ъ:
Лактоза 2,0
Барда 1,5
Автолизированные 0,5 дрожжи рН перед стерилизацией 7,0 было инокулировано содержимым замороженной ампулы streptornvces aveI"vniti(Iis MA 4848 и инкубировано во вращающемся взбалтывателе при 28 С в течение 24 ч при скорости вращения
150 об/мин.
10 мл этой ферментационной среды используют для инокуляции такой же среды в двухлитровой колбе Эрленмейера. Ферментационная среда инкубировалась при 28 С 24 ч при
50 об/мин во вращающемся взбалтывателе.
Все эти среды затем применяют для инокулирования 467 л соеды в бродильном чане емкостью 756 л состава,вес.Ъ:
Лактоза 2,0
Барда 1,5
Автолизированные 0,5 дрожжи
Полигликоль 2000 мл,л. 0,32 рН перед стерилизацией 7,0
Ферментационную среду инкубируют при 28 С 40 ч пропусканием воздуха (9 мз/мин) при перемешинании со скоростью 130 об/мин.
2 30 л этой среды используют для инокулирования находящейся н бродильном чане иэ нержавеющей стали емкостью 5760 л среды следующего состава, вес.Ъ:
Декстроз а 4,5, Пептонизированное молоко
Антолизиронанные дрожжи
0,25
Поли гликоль, мл/л 2,5 рН перед стерилизацией 7,0
Ферментацию продолжают 144 ч при
26 С путем пропускания воздуха — 49 м /мм и перемешивании со rwnpocтью вращения мещалки 120 об/мин.
Ферментационную среду отфильтровывают, фильтровальиый жмых мицелия проминают 550 л воды и Аильтрат и .промывные воды, отбрасывают. Фильт21
716524
Пример 5. В колонку диамет- 55 ром 20 см загружают слой 34 кг активированного глинозема и затем слой
34 кг активированного угля в хлористом метилене. Остаток из предыдущего примера растворяют в хлористом метилене доводя объем до 34 л, зали/ вают в колонку и элюируют 34 л,: хлористого метилена и эти фракции отбрасывают. В колонку подают ЗЪ-ный раствор изопропанола в хлористом метилене (20,8 л изопропанола и 660 л тровальный жмых взмучивают в течение 1 ч с 500 л ацетона и отфильтровывают. Отфильтрованный жмых промывают 150 л ацетона и 40 л воды и получают около 2000 л экстракта.
Ферментацию и экстракцию повторяют в тех we количествах и получают. еще 2000 л ацетонового экстракта, который затем объединяют с первым экстрактом и упаривают до 800 л с помощью концентрированной соляной кислоты; рН концентрата устанавливают 4,7 и добавляют 800 л хлористого метилена ° Объединенные растворители перемешивают 4 ч и слои разделяют. К водному слою добавляют еще 600 л хлористого метилена и церемешивают 4 ч. Слои разделяют H каждый экстракт отдельно обрабатывают. Оба экстракта упаривают до общего объема 60 л.
П р имер 4, 60 л раствора; 20 из предыдущего примера ударивают досуха в вакууме для удаления остаточного хлористого метилена и к остатку
3 раза добавляют по 60 л метанола.
Конечный .объем метанольного концен- 2$ трата 36 л. Метанольный раствор выдерживают ночь и отфильтровывают. Фильтровальный жмых промывают 40 л свежего метанола и фильтраты и прорывные воды объединяют, Затем в метанольный 30 раствор добавляют 95 л этиленгликоля и 130 л гептана. Двухслойный раствор проьювают смесью 20 л этиленгликоля и 6, 3 л метанола. Спустя 5 мин после перемешивания,нижний слой от- у
:деляют и объединяют с первым этиленгликоль-метаноловым экстрактом.
К этому экстракту добавляют равный объем воды (около 150 л), содержащей 79 г соли на 1 л. Полученный раствор экстрагируют 150 л эфира и перемешивают в течение 5 мин.
Эфирный слой промывают 75 л воды (1/2 объема), перемешивают 5 мин и слои разделяют. Этот процесс повторяют еще 2 раза (промывная вода содержит 20 r соли на 1 л). Эфирный слой упаривают в вакууме до минимального объема при температуре менее 25 С. К остатку добавляют
40 л хлористого метилена и раствор 50 выпаривают досуха. Этот процесс повторяют и конечный остаток концентрируют в вакууме досуха. хлористого метилена) и элюируют, отбирая фракции-200 л. Эти фракции упаривают в вакууме на бане, нагретой до 60 С, до объема 20 л, Затем о снижают температуру бани до 45 С, экстракт выпа