Способ получения протопластов растений

Способ получения протопластов растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О-Й И С-А-Й

Союз Советских

Социалистических

Республик

И Е

«п718О52

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВЙДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 1309.78(21) 2663481/30-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (51)М. Кл 2

A 01 G 7/00

Государственный комитет

СССР по дедам изобретений н открытий (53) УДК 576. 311:

:543.9(088.8) Опубликовано 28.02.80. Бюллетень ¹ 8

Дата опубликования описания 290280 (72) Авторы изобретения

N.Н.Прохоров, Е.A.Åôðeìåíêî, Л.В.Охрименко и B.Â.×èãðèí

Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТОПЛАСТОВ РДСТЕНИй

Изобретение относится к общим вопросам ботаники и может быть использовано в области генетики, селекции, физиологии растений и фитапато- . логии.

Известны способы выделения протопластов из растений, основанные на использовании пектоцеллулолитических ферментных комплексов, растворяющих клеточную стенку. При этом отрезки листьев или других органов растений, помещенные в соответствующий ферментный раствор, инкубируют определенное время в темноте при 21-26оС Затем живые протопласты, вышедшие в раствор, отделяют путем центрифугирования от остатков тканей и разрушенных клеток, после чего их используйт в различных целях (Ц, (23и (3) °

Известен способ выделеяйя НрОТО" пластов с помощью ферментного комплекса ((Целлулизин 7M (Се11а1увЗп, ТИ) выпуСкаемого фирмой (Calb1o

chem, при котором ферментативную обработку листьев проводят при 24оС в 1%-ном растворе целлюлизина (4).

Однако целлюлолитический ° êîìïëåêc . повреждает или разрушает определен" ное количество клеток, так как ферментатнвная обработка проводится в относительно концентрированном раст- воре целлулизина и при температуре, оптимальной для всех биохимических процессов, в том числе и для реакций, связанных с повреждением клеток.

Целью изобретения является повышение качества протопластов при их получении из растений.

Цель достигается тем, что для rioлучения протопластов обработку ферментным комплексом (например, цел- лулизином ТМ) проводят в интервале низких положительных температур

4-16 С, а концентрацию ферментного препарата варьируют в пределах

0,05-0,5% в зависимости от условий работы.

Понижение температуры и уменьшение концентрации ферментного препарата снижают его токсическое действие на живые клетки, благодаря чему повышается качество протопластов.

Изобретение основано на выявленном свойстве плазмелемм растительных клеток по-разному реагировать на воздействие повреждакщих факторов (например, повреждающих компонентов ферментного препарата) в зависимости от некоторых условий, в

718052 частности от концентрации целлулизина и температуры инкубации. в йем отрезков -лйстьев.

Пример 1; HcIihtzmiazd влйя=" ние концентрации целлулизина на качественный выход протопластов. Целлулизин испытывают в концентрициях

0,05%< 0,5Ъ, 1%, 2Ъ и 5Ъ. Опыт ставят трижды, в 3-5 повторностях. Отрезки листьев 10-дневных проростков пшеницы сорта Капли после удаления эпидермиса с нижней стороны листа

-помещают B бюксы на поверхность

"0,28 M CaC2, содержащего целлулизин в одной из:указанных концентраций.

Каждый бюкс диаметром 30 мм содер- . жит. 1,5 мл такого раствора. В каждом бюксе .учитывают навеску листьев. Инкубацию проводят в термостате при

25"C в течение 3 ч. По ее окончании бюксы осторожно встряхивают для рав-: ноМерного распределения протОплас-, 2Î тоз в объеме раствора и пипеткой отбирают пробу для подсчета клеток к камере Горяева. Подсчет клеток осуществляют каждый раз в объеме

0,9 мм . Результаты IioêàçûâàIoò, что .количественный выход протопластов иэ

1 г листьев при повышении концентрации целлулизина от 0,5%.и вйше существенно не увеличивается. Некоторое его увеличение при концентрации З() фермента 5% сопровождается резким увеличением количества поврежденных и 1эазрушенных клеток.

Формула изобретения

В связи с этим концентрацйя целлулизина 0,5% была оценена как опти=, мальная.

Пример 2. Изучают влияние температуры, при которой пройсходит инкубация листьев в ферменте, 4() на качество получаемых !протопластов.:

После удаления эпидермиса с нижней стороны. отрезки. листьев 10-,дневных

" проростков пшеницы сорта Капли помещают в" бюксы на поверхность 0,5% целлулизийа, растворенного в 0,28 М

СаС2 . Инкубацию проводят в следующих условиях:Т вариант: при 4 С, 17 ч; 11 вариант: при 16 С 6 чу

111 вариант: при 25 С, 2 ч. Колй- 5п чество выделившихся во всех вариантах протопластов находится в преде лах 5.10 - 7 10 шт в 1 мл раствора., Анализ кажд* ого варианта осуществляют в; 5-7 повторностях. Опыт ставят четыре раза..Наблюдения показывают, что все выделившиеся в раствор клетки мбжно подразделить на 3 типаг нормальные сферические протопласты

ЦНИИПИ Заказ 9980/5

Тираж 723 Подписное

Ужгород, ул. Прбектная, 4

Филиал ППП Патент, г. поврежденные протопласты (правильная сферическая форма часто утраФ чена, в месте повреждения на плазмалемме имеются выпуклости, куда стягивается значительная часть цитоплаэмы, заметна деструкция части хлоропластов или их выход из клетки в месте повреждения IgIasMaIIe разрушенные. протопласты.

При анализе и подсчете число поврежденных и разрушенных протопластов объедяниют вместе в графу Дефектные протопласты . Для нормальных протопластов вычисляют. их процентную долю от общего числа.

Данные опыта показывают, что по-. нижение температуры инкубации до 4 С повышает выход неповрежденных протопластов почти на 20%. Увеличение доли нормальных протопластов (11%) дает . также снижение температуры инкуба ции с 25 до 16ОС.

Аналогичйые- результаты получают в опытах с протопластами из проростков овса.

Применение иЗЬбретения позволит повысить -выход неповрежденных протопластов на 11-20%, а также повысить технологичность работ, связанных с его йспользованием, поскольку изменения температурного режима и концентрации .фермента позволяют варьировать временем инкубации.

Способ получения протопластов растений, включающий отделение или надрезание эфидермиса и инкубацию отрезков органов в расвторе ферментного пектоцеллюлолитического комплекса, отличающийся тем, что, с целью повышения качества протопластов, инкубацию проводят при 4-16оC .и концентрации ферментного комплекса 0,05-0," 5Ъ.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Wakasa К. isolation of protoplasts from various plant organs.

japan j Genet, 1973, 48: 279-289.

2. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М., Изолированные протопласты высших растений и конструирование растительной клетки. Киев, Наукова думка, 1973.

3. Герасимов С.Б. Новый способ получения ::.,отопластов растений.-Доклады ВАСХНИИЛ, Р 3, 1976, с. 22-23.

4 ° Brenneman F.N., Galston A.М.

Biochemic апй Physiol. der Pflangen, 1975, 168:453-471 (прототип).