Способ регенерации растений люцерны из клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП И А-"

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союз Советских

Социалистических

Рес убл пп721О36

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 28. 11.78 (2! ) 27 12086/30- 15 (51)М. Кд.

А 01 Н 3/00 с присоединением заявки Мтааударетаааама камнтет

СССР в делам «зебретениа н атхрытвв (23) Приоритет

Опубликовано 15.03.80. Бюллетень М 10 (53) УДК 631.533 (088.8) Дата опубликования описания 17..03.80 (72) Автор изобретения

А. В. Мезенцев

Всесоюзный ордейа Трудового Красного Знамени научноисследовательский институт кормов им. В. P. Вильямса (73) Заявитель (54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ

ИЗ КЛЕТОК

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может бьггь использовано в селекции и семеноводстве растений, в частности в селекции на клеточном уровне и для. ускоренного размножения и оздоровления селекционного материала, а также возделываемых сортов и гибридов люцерны, в исследованиях по фитопатологии, физиологии и генетике растений.

Известен способ регенерации растений люцерны из клеток суспенэионных культур, которые получают из каллусов, образовашихся из завязей. Регенерацию

r растений осуществляют с использованием питательной среды, в которую введен дрожжевой экстракт — компонент неопределенного химического составами.13.

Недостатком этого способа является то, что регенерация растений возможна лишь при наличии цветущих форм, завязи которых служат исходным материалом для получения каллусов и суспеяэиойных культур клеток. Таким образом, данный способ не применим в работе с растениями, находящимися в более ранней фазе раэвития, нецветущими гаплоидами и мутантами. Минимальный срок, необходимый для получения регенерантов этим cTIocoбом, очень длителен и составляет не менее пяти месяцев. К тому же введение в питательную среду компонента неопределенного химического состава (дрожжевой экстракт) затрудняет воспроизводимость результатов.

Известен также способ регенерации растений люцерны из каллусов листового происхождения на агазированных питательных средах(2). Однако этот способ не применим в селекции на клеточном уровне и не позволяет получать большое число регенерантов в расчете на

1 каллус (в среднем получают 10 растений на 1 каллус).

Целью изобретения является ускорение процесса регенерации растений люцерны иэ клеток с использованием питательной среды определенного хнмичес721036

45

2

0,25

0,025

0,025

0,75

3 кого состава и одновременное оздоровление исходного материала от бактериальной, грибной и вирусной инфекции.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве агаризованной питатель5 ной среды используют агаризованную среду Гамборга Ь - с повышенным содержанием железа (!! ) сернокислого и трилона 6, после образования каллусов последние помещают в жидкую среду 10

Гвмборга В>, в которую. в качестве фитогормонов вводят 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и бензиламинопурин, а полученные суспензии клеток переносят в Жидкую среду Гамборгв б без фитогор- !5 монов и пересажйвают образовавшиеся из клеток эмбриоиды на агаризованную среду Гамборга Б без гормонов.

Способ осуществляется следующим образом. 20

Листочки, т.е. пластинки тройчатого листа, культивируемых сортов и гибридов люцерны стерилизуют в 0,1%-ном водном растворе диоцида и после трех кратной промывки в стерильной дистилли- 25 рованной воде делают нв каждом из них ряд надрезов по всей плошади пластинки и помещают на основную питательную среду Гвмборга 55, в которую дополнительно вводят 6000-8000 мг/л бактоагара и 200-300 мг/л нитрата аммония,:. содержание сахарозы увели.чивают до 25000-35000 мг/л, железа (Й ) сернокислого FeSQ4 «Н О до

70-100 мг/л, трилона Б до 90-130мг/л 35 и вносят следующие фитогормоны: 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)

8-16 мг/л, кинетин 6-10 мг/л и

< -нафтилуксусную кислоту (НУК)

0,1-0,5 мг/л, рН среды доводят до 40

5,8-6,0. Состав среды йредставлен йиже.

Макроэлементы Содержание, мг/л.

К Воз .2500 йаН Р04 ИРО 150 (NH4) SO 134 мадо, «Й,о

Сс СЮ 2Н О 150

Ге з04 7 !-! 0 28

Трилон Б . 37

Микроэлементы

Нп S04 Н 0 !

-! во

Zë SO4 7Н О î- мо04 .2!-! О

С„Саг 6Н,О

КХ

Цитамины

Никотиновая кислота 1

Тиами -HC0 10

Пиридоксин-НСР 1

Миоинозит 100

Сахароза 20000 рН среды 5,5

Материал инкубируют 2-3 недели при непрерывном освещении люминесцентными .лампами (освещенность 0,5»

4,0 тыс. лк), температуре 26 1о С и относительной влажности 95-100% в закрытых прозрачных сосудах.

В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды, вирусная инфекция устраняется под воздействием фитогормонов.

Через 2-3 недели развившиеся каллусы переносят на ту же питательную среду, но без бактоагвра, нитрата аммония, кинетина и НУК, содержание железа ft сернокислого и трилона Б уменьшают цо

28 и 37 мг/л соответственно (т.е.; как в среде В5 ), содержание 2,4-Д уменьшают до 0,1-0,2 мг/л и вводят дополнительно фитогормон — бензиламинопурин (БАП) 0,1-0,2 мг/л. Материал инкубируют 1-2 недели в закрытых прозрачных сосудах на встряхиваюших аппаратах с числом колебаний 100-125 мин, йри тех же параметрах освещенности, температуры и влажности, которые используют при инкубвции листочков. Образовашиеся суспензии клеток субкульти-г вируют каждые две недели путем добавления к 4-6 объемам свежей среды того же состава 1 объема суспензии.

Для получения регенерантов к 4-6 объемам свежей среды того же состава, но без фитогормонов добавляют 1 объем суспензии клеток и инкубируют в тех же условиях.

Через 1-2 недели образовавшиеся из клеток зеленые эмбриоиды (соматические зародыши) переносят на агаризовайную среду Гамборга В5 без гормонов. Условия инкубвции остаются прежними, но длину фотопериоцв сокращают до .16 ч-в 1 сут. По мере развития растений на этой среде и появления у них двух-трех тройчатых листьев и корней их пересаживают в почву и выращивают в обычных условиях.

Работу, свазвнную со стерилизацией листьев, субкультивированием суспензий

40

2. Авторское свидетельство СССР

55 по "àÿâêå N0 2465483/30-15, кл. А 01 Н 3/00, 1977 (прототип).

Тираж 723 Подписное

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 7210 и пересадкой эмбриоидов, проводят в асептических условиях.

" Пример. Проводилась регенерация растений из клеток суспензионных культур синей люцерйы сортов Рамблер, 5

Зайкевича и желтой сорта Дединовская.

При этом были получены следующие результаты: 96% листочков, помещенных на питательную среду с тремя фитогормонами, образовывали через 2-3 недели каллусы. Последние помещали в жидкую питательную среду с 0,1-0,2 мг/л БАП и 0,1-0,2 мг/л 2,4-Д и инкубировали на аппарате АВУ-1 (аппарат универсальный дпя встряхивания жидкости в колбах и пробирках) при 100-125 колебаний в 1 мин и амплитуде колебаний .2030 мм. В течение 1-2 недель из каллусов образовывалась суспензия клеток, содержащая более 100 тыс. клеток в 2п

1 мл. Полученную суспензию субкультивировали каждые две недели путем добавления к.4-6 объемам свежей среды того же состава 1 объема суспензии.

Для регенерации растений из клеток суспензионных культур к 4-6 объемам свежей среды без гормонов добавляли

1 объем суспензии. Через 1-2 недели из клеток суспензионных культур образовывались хорошо развитые зеленые 30 эмбриоиды (в среднем 200 эмбриоидов

B 1 мл), которые пересаживали на агаризованную среду без гормонов. Через

2-3 недели из эмбриоидов развивались растения с 2-3 тройчатыми листьями з5 и корнями. Последние пересаживали в почву и выращивали в обычных условиях, ;где они цвели и образовывали семена. Полученные растения-регенеранты были .свободны от фитопатогенной инфекции.

Весь процесс от получения каллусов до регенерации растений занимал в среднем два месяца. Выход, регенерантов . в расчете на 1 каллус, без субкультивирования суспензии, составлял в среднем 25 тыс.. 45 растений, при трехкратном субкультивированни — 625 тыс. растений.

Использование изобретения позволяет значительно ускорить процесс размножения и оздоровления люцерны за счет ускорения процесса регенерации растений из клеток суспензионных культур, а также расширить исходный материал, иопользуемый в селекции на клеточном уровне за счет нецветущих гаплоидов и мутантов. В селекционно-семеноводчесЦНИИПИ Заказ 2/1

36 б кой работе с люцерной этот способ позволяет значительно сокрптить выведение и испытание новьк сортов и гибридов, а также расширить посевы этой ценной кормовой культуры.

Формула изобретения

1. Способ регенерации растений люцерны из клеток, включающий получение каллусов на агаризованной питательной среде с последующей пересадкой их на питательные среды, выращивание суспензий клеток с последующим получением из них почек, эмбриоидов и растений, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса регенерации растений и оздоровления их, в качестве агаризованной питательной среды используют агаризованную среду Гамборга В с повышенным содержанием железа { II ) сернокислого и трилона Б, после образования каллусов последние помещают в жидкую среду Гамборга Â, в которую в качестве фитогормонов вводят 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и бензиламинопурин, а полученные суспензии клеток переносят в жидкую среду Гамборга В без фитогормонов и пересаживают образовашиеся из клеток эмбриопды на агаризованную среду Гамборга В> без гормонов.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что содержание железа Ii сернокислого (Ге$0д 7Н О ) в среде Гамборга Вб составляет 70100 мг/л, а трилона Б 90-130 мг/л.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и бензиламинопурин вводят в жидкую среду Гамборга В, в количестве 0,1-0,2 мг/л.

4. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что суспензии клеток переносят в жидкую среду Гамборга В без фитогормонов в соотношении объемов 1:4-6.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Т. 3; Ие. IIov, Е.Т. Ь ingharn, PII.ant

Sc ence. LetII.его, 1 977, 10, 1: 59-66.