Способ выделения ацетилхолинэстеразы

Способ выделения ацетилхолинэстеразы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Сеюа Сееетсимв

Сее1иелмстичесннт

Республик

G A H C A H И K,721450

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 10.06.77 (21) 2495565/23-04 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 15.03.80. Бюллетень М 10 (51) М. Кл.

С 07 G 7/02

Веудерстееввй кемвтет

СССР де делам взверетеввв в еткрмтвв (53) УДК577 15. .07 (088. 8 ) Дата опубликования описания 17.03.80

В. А. Смирнов и А. H. Панюков (72) Авторы изобретения

Институт токсикологии Министерства здравоохранения СССР "--. (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АПЕТА ИЛХOЛИНЭСTEPАЗЫ

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам очистки ферментных препаратов — к спссобу выделения ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7) из яда среднеазиатской кобры.

11елевой продукт может быть использован в качестве лекарственного средства, например, при лечении шоковых состояний, а также как компонент систем

1О для определения низких концентраций фосфорорганических инсектицидов.

Известны способы выделения ацетилхолинэстеразы из животных тканей, например из ткани мозга (1).

Известен способ выделения ацетиляолинэстеразы (АХЭ) нз яда среднеазиатской кобры путем двухступенчатой колоночной хроматографии на сульфоэтилпроизводном декстрана в буферных растворах f23.

Преимушеством этого способа является использование в качестве источника фермента яда среднеазиатской коб. ры, отличаюшегося высоким содержанием

АХЭ {около 20000 Е/г сухого яда).

Недостатки известного способа состоят в низкой удельной активности получаемого препарата (61 Е/мг белка) и в низком выходе фермента (13%). Эти недостатки обусловлены тем, что используемое в качестве ионообменного сорбеита сильнокислое сульфоэтилпроизводное декстрана вызывает в процессе выделения значительную денатурацию фермента.

11епью предлагаемого способа является устранение недостатков известного способа, а именно получение из яда кобры АХЭ с высокой удельной активностью и с высоким выходом. Другой целью является комплексное использованне яда.

Согласно изобретению выделение фермента из яда кобры проводят ступен чатой колоночной хроматографией с ис» пользованием на первом этапе слабокислого ионообменника, карбокснметил72 1450 производного декстрвна, в буферном растворе. На атом этапе наряду с АХЭ удается получить препараты пяти низкомолекулярных физиологически активных пептидов, что приводит к более полному 5 использованию дефицитного сырья. Последующую очистку целевого продукта проводят последовательной хроматографией на колонках с диатиламиноэтилпроизводным декстрана и с гранулированным гидроксиапатитом в буферных растворах, содержащих в качестве стабилизатора активности фермента глицерин в количестве 10 вес. .

Согласно изобретению предлагается

15 способ выделения ацетилхолинэстеразы из яда среднеазиатской кобры с высокой удельной активностью фермента и высоким выходом, при комплексном использовании сырья:путем ступенчатой колоночной хро20 матографии с использованием на первой ступени карбоксиметилпроизводного декстранв, HB второй ступени — диэтиламиноатилпроизводного декстрвна, а на третьей - гидроксиапатита. Способ осуществ ляют в присутствии буферов и-предпочтительно при 2 — 8 С. Элюцию ацетилО холинэстеразы на первой ступени осуществляют обычно линейным градиентом, образованным смешиванием 0,01 М уксусно-аммонийного буфера рН 5,0

1,0 М уксусно-аммонийным буфером рН 7,0. Элюцию АХЭ на второй ступени осуществляют обычно линейным градиен35 том, образованным смешиванием 0,01 М . трис- НСК буфера рН 7,8 с 0,5 М раствором. МаСц в том же буфере.

Элюцию АХЭ на третьей ступени осуществляют обычно 0,5 М раствором NoC в 0,01 М Иа-фосфатном буфере рН 7,6.

Буферные растворы на второй и третьей ступенях содер>квт глицерин: в количестве 10 вес.%.

Предпочтительно процесс выделения

АХЭ проводят следующим образом.

Обессоленный яд среднеазиатской кобры наслаивают на колонку с карбоксиметилпроизводным декстрана, уравновешенным уксусно-аммонийным буфером рН 5,0. Элюцию связавшегося материала производят линейным (по молярности буферных растворов) градиентом, образованным смешением уравновешивающего буфера с 1,0 М уксусно-аммонийным буфером рН 7,0. При атом наряду с препаратом ь АХЭ удается получить лре1 параты пяти,низкомолекулярных физиологически активных пептидов. Использование на первом этапе очистки АХЭ слабокислого производного декстрана позволяет снизить денатурвцию фермента, наблюдаемую при использовании сильнокислого производного декстрана. Последующая очистка целевого продукта проводится на диэтиламиноэтилпроизводном декстрана. Для снижения денвтурации

АХЭ с этого этапа очистки в буферные растворы добавляют глицерин (10% по объему). Элюцию АХЭ с колонки с диэтиламиноэтилпроизводным декстрана, уравновешенным 0,01 М трис-НСФ буфером рН 7,8, содержащим 10% глицерина, проводят линейным градиентом, образованным смешением уравновешивающего буфера с 0,5 М 11аСЯ д том же буфере. Последний атап .очистж состоит в хроматографии АХЭ на колонке с гранулированным гидроксивпатитом, уравновешенным 0,01 N йо -фосфатным буфером рН 7,6, содержащим 10% глицерина. Элюцию фермента проводят 0,5 М

ИаСК в том же буфере. Этот этап выделения позволяет в еще большой степени очистить и сконцентрировать целевой продукт. Замена на этом этапе трис-НС8 буфера на фосфатный облегчает определение концентрации белка методом

Лоури.

Полученный препарат АХЭ, как следует из результатов электрофоретического анализа, гомогенен. Молекулярный вес фермента 1 10000 т. 10000. Фермент гидролпзует ацетилхолин АТХ (К„;1,3х х10 М), мехолин (К„=2,2х10 М) и практически не гидролизует бутирилхолин. Высокие концентрации ацетилхолина и мехолина угнетают активность фермента.

Величины констант второго порядка взаимодействия препаратов АХЭ с фосфорорганическими ингибиторвми АХЭ составляют (0,85-6,7) х 10. М мин 1, что в 2 раза выше констант взаимодействия этих же соединений с препаратом

АХЭ из эритроцитов человека (АХЭЧ).

Разбавленный раствор фермента (1Е/ил) в забуференном растворе (0,02 М натрийфосфат рН 7,6) альбумина (0,2%) или глицерина (1O ) инактивируется при

37 С нв 107 за 1 ч, а при (4-6) С нв

О о

10% за 1 сут. Температурный оптимум гидролиза ATX ферментом, разбавленным

0,15 М Na<<, составляет 20 С, а фермента, разбавленного раствором вльбчмина (0,2%) или глицерина (10%)

37 C.

5 72

Пример.

1) Высушенный над хлористым кальцием яд кобры (2 r, удельная активность

АХЭ-26 Е/мг сухого яда) растворяют в 20 мп дистиллированной воды и обессоливают на колонке (Зх60 см) с сефадексом Г-15, уравновешенным 0,01 M уксусно-аммонийным буфером рН 5,0.

Скорость элюции 48 мл/ч.

2) Обессоленный яд (около 30 мл раствора) наслаивают на колонку (Зх х60 см) сКМ- сефадексом С-50, уравновешенным этим же буфером, и элюируют градиентом, образованным смешиванием 2,5 и этого же буфера с 2,5 л

1,0 М уксусно-аммонийного буфера рН 7,0. АХЭ выходит при концентрации соли около 0,4 М в объеме 120 мл.

Выход фермента 98%, очистка в 48 раз.

3) Раствор фермента, полученный на этапе 2, разбавляют в 5 раэ 0,0 1 M трис-НС0. буфером рН 7,8 и добавляют глицерин до 10 /О, после чего наслаивают на колонку (2,5х20 см) с ДЭАЭ-сефадексом А-50, уравновешенным 0,01 М трис-НСЮ, буфером рН 7,8 с 10/о глицерина. Эпюцию связавшихся белков проводят градиентом, образованным смешиванием 0,5 л этого буфера с 0,5 л

0,5 M ЙаСЮ в этом же буфере. АХЭ выходит при концентрации Май около 0,15 M в объеме 150 мл. Выход фермента около 55%, очистка в 196 раз.

4) Раствор фермента, полученный на этапе 3, разбавляют в 5 раз 0,01 М натрийфосфатным буфером рН 7,6 с 10% глицерина и наслаивают на колонку (2x10 см) с гранулированным гидроксиапатитом. Колонку промывают буфером и элюируют связавшийся фермент 0,5 М

ИаСЮ в этом же буфере. Получают

20 мп раствора АХЭ. Выход фермента

400 активность 9670 E/ мг белка.

5) Раствор фермента, полученный на этапе 4, обезвоживают пиофипизацией.

Раствор фермента в глицерине хранится о при 4-6 С без потери активности. Все операции по выделению фермента проводят при (4-6)+ 2 С. Активность феро мента определяют по гидролизу ацетилтиохолина (АТХ), 1Е активности соответствует количеству фермента, гапролиэующего 1 мк моль АТХ эа

1 мин.

1450 6

Формула изобреreния

1. Способ выделения ацетипхопицэстеразы из яда среднеазиатской кобры путем ступенчатой копоночкой хромато5 грвфпи на производных декстрана в буферных растворах, о т л и ч в ю ш и йс я тем, что, с целью получения ацетилхопинэстеразы с высокой удельной активностью и увеличения выхода целевого продукта, а также с целью комплексного использования яда, колоночную хроматографию осуществляют в три ступени, в качестве производного декстрана на первой ступени применяют карбоксиметилпроизводное декстрана, на второй — диэтиламиноэтилцроизводное декстрана, а хроматографирование на третьей ступени осуществляют на гидроксиапатите, причем буферные растворы на второй и третьейсту20 пенях содержат глицеринв na m m910%.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юш и и с я тем, что выделение ацетилхоо ппнэстеразы проводят при 2-8 С.

3.Способпопп. l и 2,отличаю 5 ш п и с я тем, что элюцию ацетнлхопинэстеразы с колонки с карбоксиметилпроизводным декстрана проводят линейным (по молярности буферных растворов) градиентом, образованным смешиванием

ЗО 0,0 1 M уксусно-аммонийного буфера рН 5,0 с 1,0 M уксусно-аммонийным буфером рН 7,0.

4. Спо"îá по пп. 1-3, о т л и ч а юш и и с я тем, что элюцию ацетилхопинэстераэы с колонки с диэтипаминоэтилпрсиэводцым декстрана проводят линейным град . энтом, образованным смешиванием 0,01 М трис — НСК буфера рН 7,8 с 0,5 M раствором МОСЮ в том

4О же буфере.

5. Способ по пп. 1 — 4, о т л и— и а ю ш и и с я тем, что эпюцию ацетил. .опинэстеразы с колонки с гра упированным гидроксиапатитом прово45 дят 0,5 М раствором ЙаСЮ и 0,01 М

No -фосфатном буфере рН 7,6.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

50 М0 267815, кл. А 61 К 37/48, 20. 12.68.

2. Нигматов 3., Сорокин В. С. Выделение холинэстеразы из яда среднеазиатской кобры. Узбекский биологи55 ческий журнал, 1972, 6. 16 (прототип).

БНИИПИ Заказ 77/21 Тираж 495 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4