Способ получения амидов 5-моноили полифосфатов олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе

Способ получения амидов 5-моноили полифосфатов олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Соеетскнк

Соцналнстнческнт

Республик

О П И С А Н И Е ()72!452 ЗОВРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6I) Дополнительное к авт. свнд-ву (5 I ) M. Кл.

С 07 Н 19/04 f

С 07 G 7/03 (22) Заявлено03.06.77 (21) 2491732/23-04 с присоединением заявки М (23) Приоритет асударстааакьй аанютет

СССР ав делам аэабратаеа я аткрмтай

Опубликовано 15.03.80. Бюллетень М 10

Дата опубликования описания 18.03.80 (53 ) УД К 547. 963.

° 32 (088,8) (72) Автори изобретения

B. B. Самуков, Г, Ф. Сиволобова и Т. Н. Шубина

Новосибирский институт органической химии СО АН СССР и Специальное конструкторско-технологическое бюро биологически активных вешеств. (7l) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИДОВ 5-МОНО- ИЛИ

35--,, —;, . ., КОНПЕВОЙ ФОСФАТНОЙ ГРУППЕ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения амидов

5-моно- или полифосфатов олигонуклео-! тидов по концевой фосфатной группе, которые находят широкое применение в молекулярной биологии для исследования матричных реакций, особенно комплементерно адресованной модификации нуклеиновых кислот, а также в качестве аффинных реагентов.

Известны способы получения амидов та

5-монофосфатов олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе с помошью дициклогексилкарбодиимида (11 или дифенилхлорфосфата P2).

Оба способа сопровождаются значитель иой побочной реакцией по межнуклеотидным фосфатным группам, возрастаюгцей с увеличением длины олигонуклеотида.

Известен также способ получения

1 20 амидов 5-моно- или полифосфатов олигоиуклеотидов 3, основанный на активаl ции концевой фосфатной группы 5-моноФосфатов олигонуклеотидов превоащением

2 ес в смешанный ангидрид при действии избытка хлорангидрида 2,4,6-триметилбензойной кислоты в сухом пиридине в течение 20-30 мин и последующем взаимодействии смешанного ангидрида с аминами в течение 2 — 3 суток в воде или х

18-20 ч в сухом диметилформамиде.

Выходы как смешанных ангидридов, так

I и 5-амидов олигонуклеотидов составляют

60-90 "o. Синтезированные амиды выделяют хроматографией на бумаге. Но синI тез 5-амидов олигонуклеотидов — двухстадийный процесс в разных растворителях, продолжительность реакции смешанных ангидридов олигонуклеотидов с аминами в воде 2-3 суток, в диметилформамиде 18-20 ч, т.е. значительная, к тому же синтез осложняется побочной реакцией по межнуклеотидным фосфатным группам, приводящей в рибо ерии к внутримолекулярно му фосфорилированию

2-гидроксила, а затем к изомеризации или разрывам межнуклеотидной связи.

721452 d

Я) Белью изобретения является упрошение процесса.

Поставленная цель достигается тем, 1 что амиды 5-моно- или полифосфатов олигонуклеотидов по концевой фосфатной группе получают при проведении реакции в смези три- или тетраалкиламмониевой соли 5- моно- или полифосфатов олигоиуклеотидов в сухом полярном апротонHGM растворителе (диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин), 3-5-кратного избытка конденсируюшего агентатрифенилфосфина-2,2 -дипиридилдисульфида, и 5-10-кратного избытка амина (рКа>5). Процесс обычно идет в течение

2-4 ч при комнатной температуре. Белевые продукты выделяют обычными приемами; осаждением реакционной смеси в эфир или ионнообменной хроматографией.

Выход целевого продукта в обоих случаях не менее 807. с

Пример 1. Синтез 5-пиперидида тридезокситимидилата.

210 ОЕ (7,1 мкмоль) триэтил аммониевой соли (dpT) растворяют в

0,2 мл сухого пиридина, добавляют к раствору 4 мкл (50 ммоль) пиперидина, 8 мг (30 ммоль) трифенилфосфина, 6,6 мг (30 ммоль) 2,2 -,дипиридилдисульфида и выдерживают в течение 3 ч

30 при комнатной температуре. Реакционную смесь добавляют к 10 мл эфира, осадок отделяют центрифугированием, промывают эфиром (Зх5 мл), высушивают в вакууме.

Выход 1 70 ОЕ б. (88%) . По данным микроколоночной хроматографии на

ЙЭАЭ-целлюлозе в системе 1 омлинсонаТенера препарат содержит 967 целевого продукта и 4% (dpT); по данным тонЗ

40 кослойной хроматографии на целлюлозных пластинках Postman-kodak в системе изопропанол:аммиак:вода — 7: 1:2 препарат содержит два вещества с И

0,75 (целевой продукт) и Rf 0,41 (dpT>, следы).

Пример 2 . Синтез р -морфоI. лида 5-пирофосфата тридезокситимидилата.

100 ОЕ (3 ммоль) триэтиламмо-. ! ниевой соли 5 -пирофосфата тридезокситимидилата (dppTpTpT) растворяют в .0,1 мл диметилсульфоксида, добавляют к раствору 2 мкл (25 ммоль) морфолина, 5,4 мг (20 ммоль) трифенилфосфина, 4,4 мг (20 ммоль) 2,2 -дипиридилсульфида и выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную

=месь разбавляют водой до 3 мл и экстрагируют эфиром (6x2 мл). Аликвоту водного слоя анализируют хроматографией на бумаге в системе этанол- 1М ацетат аммония, рН 7,5 (7:3). Обнаружено два пятна с Rf 0,24 (целевой. продукт) и Rf 0,08 (dppTpTpT, следы).

По данным микроколоночной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в системе

Томлинсона-Тенера препарат (водный слой) содержит 95% целевого продукта.

Выход 82 ОЕ а (82%).

Пример 3 . Синтез 5-бензиламида дидезокситимидилата.

100 мг (0>11 ммоль) триэтиламмо,нийной соли (dpT)< растворяют в 1 мл сухого пиридина, добавляют к раствору

100 мкл (0,9 ммоль) бензиламина, f

66 мг (0,3 ммоль) 2,2-дипиридилдисульфида, 78 мг (0,3 ммоль) трифенилфосфина и выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре. В спектре

ЯМР- "P реакционной смеси наблюдаются сигналы с химсдвигами + 1,9 м.д. (межнуклеотидный фосфат) и -7,l м.д. (5 -концевой амидоэфирный фосфат), соотношение интенсивностей 1:1, а также сигнал трифенилфосфинокиси (-25,7 м.д.).

Реакционную смесь добавляют к 25 мл эфира, осадок отделяют центрифугированием, промывают эфиром (4х10 мл), высушивают в вакууме, Выход 100 мг (100%). Гомогенность препарата подтверждается i СХ на пластинке "Si9ufoP" в системе СН СИ - Н О (4: 1), 0,ЗЗ.

Формула изобретения (l. Способ получения амидов 5-моно-или полифосфатов олигонуклеотидов ло концевой фосфатной группе в сухом полярном апротонном растворителе в присутствии амина (pKa>5), о т л и— ч а ю ш и Й с я тем, что, с целью у»рошения процесса, реакцию ведут в смеси три- или тетраалкиламмониевой соли

5-моно- или полифосфатов олигонуклеотцдов, 3-5-кратного избытка трифенилI фосфина-2,2 -дипиридилдисульфида и

5-10-кратного избытка амина.

Ф

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Соколова A. И., Гати»<:кая Л. Г., Недбай В. К., Смирнов В. Д..Рухляда J 1. t I., 1Дебяоова 3. А. и Прокофьев M. А.

Синтез амидов олигонукпеотидов ДАН

СССР (1971) 196 11о 3 с. 613-615.

2. Воробьев О. Е., Шабарова 3.А., Прокофьев M.A. Синтез нуклеотидил

721453 6 (5-+N) фенилаланина пирофосфатным методом, ЖОХ (1964) 34, с. 359-261, 3."МисФек Асов Repeavch", 1976, 3, N. 4, с. 903-916 (прототип) °

Составитель Л. Никулина

PEgBK г 1 П. Новожилова Техред Н. Ковалева Корректор М. Вигула

Заказ 79/22 Тираж 495 Подписное

Ц11ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фи, :пл ППП Патент", r. Ужгород ул. Проектная, 4