Способ культивирования -форм

Способ культивирования -форм

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Ь

I.

f:þ

Союз Советских

Социалистических

Республик

О" П И= С---А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

<»>721489

4

// —. .

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (Ь1) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 090377 (21) 2460904/28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 150380. 8кзллетень ¹ 10

Дата опубликования описания 18.0380 (51)м. К>.2

С 12 К 3/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК576.856, ° 61 (088.8) (72) Автор изобретения

Л.М, Устименко

Казанский государственный институт усовершенствования врачей (71) Заявитель (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ -ФОРМ

ЭВЕРОМЕМА РАШПОМ

Изобретение относится к области микробиологии, Известен способ культивирования

L-форм Эгоропета ра ЮОнгп путем 5 пассирования культур Ь-форм на питательных средах в присутствии постепенно возрастающих концентраций пенициллина и инкубированием посевов (1), 10

Однако при известном способе удается поддерживать культуры в L-форме лишь в нескольких пассажах (3-10), а потом L-формы перестают расти . о

Белью изобретения является длительное поддержание культуры в Lформе.

Эта цель достигается тем, что 20 проводят пассаж на жидкую питательную среду, после инкубирования пересевают на полужидкую питательную среду, посев инкубируют до появления вторичного роста культуры, затем 25 пересевают на жидкую питательную среду, причем пенициллин вводят в питательную среду в каждом тассаже при появлении первых признаков роста, Кроме того, концентрацию пеницилдина от пассажа к пассажу повышают до 4000 ЕД/мл, Способ осуществляют следующим образом.

L-Формы бледной трепонемы любого штамма, индуцированные или постиндуцированные, засевают по 0,3 мл на среду Китта-Тароцци или íà срем у

Китта-Тароцци с нормальной лошадиной сывороткой, Мо$0д и сахарозой, "После посева среду заливают слоем стерильного расплавленного вазелина, Посевы инкубируют в термостате при

36-38оС (оптимальная 37 g);. ежеднев" но просматривают, При появлеиии первых признаков видимого роста, что выражается легким помутнением среды и наличием активных размножающихся трепонем при микроскопии препаратов раздавленная капля под фазовоконтрастным или темнопольным микроскопом, в среду добавляют водный раствор пенициллина так, чтобы концентрация антибиотика в среде (ЕД/мл) была такой же, как и Ь-индуцирующая, при которой были получены L-формы у данной культуры, Посевы после этого

721489 снова выдерживают 4-7 дней в термостате. Через укаэанный срок культуру со среды Китт а-Т ароцци пере севают в столбик полужидкого агара на основе триптического перевара бычьего сердца или пептона Мартена с нормальной лошадиной сывороткой, нор; мальной сывороткой морской свинки,i с MgSO и сахароэой. Все тщательно перемешивают. Посев инкубируют в термостате при 36-38 С (оптимальная

37 С) и ежедневно просматривают, При появлении первых признаков видимого роста, что выражается легким помутнением среды или появлением отдельных колоний в нижних двух третях столбика среды и наличием ак» тивных размножающихся трепонем при микроскопии препаратов, в среду вносят раствор пенициллина так,чтобы концентрация его в среде быпа в

1,5-2 раза больше предыдущей в среде Китта-Тароцци, Посев снова инкубируют при 36-38 С (оптимальная

37 C), Добавление пенициллина вызывает процесс L-трансформации, В течение 15-20 дней бледная трепонема полностью превращается в L-формы, Инкубацию посевов в термостате продолжают до реверсии L-форм, что выражается появлением на 26-60-й день после посева второй волны роста вторичного роста. Это сопровождается увеличением и нарастанием интенсивности зон помутнения в столбике среды, а по периферии L-колоний появляются нежные облачковидные ореолы.

В препаратах, приготовленных иэ этих зон роста, под фаэовоконтрастным микроскопом обнаруживается реверсия

L-форм и появление спиралевидных трепонем. Культуру вторичного роста пересевают сразу же или в пределах одного месяца на среду Китта-Тароции или на среду Китта-Тароцци со всеми укаэанными выше компонентами и далее культивирование L-форм осуществляют в той же последовательности,как описано, в зависимости от поставленной задачи по длительности культивирования L-форм, Концентрации пенициллина в процессе культивирования познают до тех пор, пока культура дает после воздействия антибиотиком на полужидкой среде вторичный рост, Если достигают предельной концентрации пенициллина, при которой вторичный рост не появляется, то посев со среды

Китта-Тароцци повторяют и культивирование продолжают беэ дальнейшего повышения концентраций пенициллина.

Предельные L-индуцирующие концентрации пенициллина зависят от индивидуальных особенностей штамма, культуры, состояния популяции, условий выращивания, Способ воспроизводим

5О

60 при концентрации пенициллина 5004000 ЕД/мл, После добавления пенициллина в жидкую среду и инкубации в термостате культуру до пересева в полужидкую среду можно хранить при комнатной температуре до года.

Предлагаемый способ может быть модифицирован следующим образом, При появлении вторичного роста на полужидкой среде эту же культуру можно снова превратить в L-формы повторным добавлением пенициллина в том же количестве, что и для индукции L-форм до вторичного роста, с продолжением инкубации посевов в термостате. Реверсия L-форм прекращается после добавления пенициллина, трепонемы снова превращаются в ?-формы, а через определенное время

L-формы снова реверсируют и появляется третья волна роста, Культура в этом состоянии также может быть пересеяна на среду Китта-Тароцци, и далее культивируют, как описано.

Способ может быть также использован и для первичного получения L-форм из исходной культуры.

Пример 1, Ь-Формы бледной трепонемы штамма Ставрополь- ц, полученные на О,ЗЪ-ном агаре,на основе триптического перевара бычьего сердца под воздействием 500 ЕД/мл пенициллина, засевают по 0,3 мл на среду Китта-Тароцци с 20% нормальной лошадиной сыворотки, 0,053

MgSOд, 10% сахарозы (объем среды

9 мл), Посевы заливают расплавленным ваз ели ном (слоем 1, 5-2 см) . Инку бацию осуществляют в термостате при 37 С, посевы ежедневно просматривают. Йа 3-й день после посева в пробирке обнаружено легкое помутнение среды. Под фазовоконтрастным микроскопом при.микроскопии препарата раздавленная капля (увеличение 40 х 10) обнаруживают хорошо подвижные, поперечно делящиеся трепонЕмы по 50-60 в поле зрения. Готовят раствор пенициллина на дистиллированной воде концентрации 5000 ЕД/мл, который вносят в среду по 1 мл, т.е. создают в питательной среде концентрацию пенициллина 500 ЕД/мл, Посевы продолжают инкубировать в термостао те при 37 С в течение недели, После внесения пенициллина через два дня в теле трепонем появляются эернагранулы, в последующие пять дней образуются цисты и шаровидные формы, отмечают незначительный зернистый распад, в то же время сохраняются отдельные спиралевидные формы, На седьмой день после внесения пенициллина делают пересев по 0,3 мл культуральной жидкости на 0,3-ный агар на основе триптического перевара бычьего сердца с 20% нормальной лошадиной

721489 сыворотки, 2% сыворотки морской свинки, 0,05% МАМБО„ и 10% сахароэы (объем среды 9 мл) ° Посевы инкубируют в термостате при 37 С и ежедневно просматривают, На седьмой день в столбике среды появляется облачковидный рост и рост отдельных колоний, При микроскопии препаратов раздавленная капля, приготовленных из эон роста или из отдельных колоний, обнаруживают трепонемы и реверсирующие Ь-элементы. Внесением в среду в этот же день 1 мл водного раствора пенициллина концентрации 10000 ЕД/мл создают концентрацию его в среде

1000 ЕД/мл.В течение 15-20 дней при микроскопии посевов наблюдают превращение трепонем в L-формы с образованием L-микроколоний с последующим ростом Ь-колоний, Культура бледной трепонемы полностью превратилась в

L-формы, а на 30-й день после посева (23-й день после внесения пенициллина) в столбике среды отмечают увеличение интенсивности помутнения и эон роста за счет появления нежного облачковидного роста по периферии зон роста и Ь-колоний, т,е. Регистрируют вторичный рост, Микроскопией культуры выявлена реверсия

L-форм с превращением их в трепонеьы, Культуру на следующий день снова пересевают на среду Китта-Тароцци с указанными компонентами, После пересева в эту же культуру вторичного роста снова вносят пенициллин иэ расчета 1000 ЕД/мл среды. Культура вторичного роста снова вся превращается в L-формы бледной трепонеma с последующей реверсией и появлением третьей волны роста на 90-й день, С посевом на среду Китта-Тароцци далее поступают так, как описано, т,е, инкубируют в термостате, при появлении первых признаков роста вносят пенициллин, выдерживают 4-7 дней в термостате, пересевают на полужидкий агар, инкубируют в термостате, при появлении первых признаков видимого роста вносят пенициллин, получают на этом этапе L-формы, продолжают инкубировать в термостате до появления вторичного роста, снова делают пересев на среду

Китта-Тароцци и т,д, По мере необходимости получают L-формы и повторным воздействием пенициллина на культуры вторичного роста с дальнейшим пересевом культур третьей волны роста на среду Китта-Тароцци и т.д. данная культура и ее структуры пассируют предложенным способом более 30 раз, Пример 2. КультурУ L-Форм бледной трепонемы штамма Ставрополь-VlllПОЛУЧаЮт ВозДействием 31 ЕД/мл пенициллина и десятикратно пассиру5

Постиндуцированные L-формы бледной трепонемы пересеяны на среду

Китта-Тароцци с 20% нормальной лоша. ют на 0,3%-ном arape на основе триптического перевара бычьего сердца с

20% нормальной лошадиной сыворотки, 1,5-2% нормальной сыворотки морской свинки, О, 0 5% Ng SO и 10% сахароэы с постепенно повышаемыми концентрациями пенициллина от 31 до

500 ЕД/мл. После этого культуру

L-форм десятого пассажа в количестве 0,3 мл пересевают на среду КиттаТароцци, заливают вазелином, инкубируют в термостате при 37 С. На 4-й день при появлении первых признаков видимого роста в среду вносят пенициллин из расчета 500 ЕД на 1 мл среды, трепонемы в течение 2-5 дней превращаются в цисты, сферические и зернистые формы. Посевы оставляют на хранение при комнатной температуре, Через год при микроскопии посевов обнаруживают цисты, зерна-гранулы. Культуры пересевают по 0,3 мп в столбик 0,3%-ного агара на основе трипткческого перевара бычьего сердца с 20% нормальной лошадиной сыворотки, 2% нормальной сыворотки морской свинки„ 0,05% M SO, 10% сахарозы, Инкубацию проводят в термостате при 37 С, На б-10-й день появляется рост большого количества очень мелких, еле видимых простым глазом колоний, которые состоят только из

L-форм, В течение 10-15 .дней колонии величиваются в размерах и пРевращают ся в L-колонии бледной трепонемы. Превращение в L-формы происходит при отсутствии L-индуцирующего агента в среде, Как показали контроли, L-колонии у пассируемой L-культуры бледной трепонемы образуются не спонтанно, а вследствие воздействия пенициллиFiа на культуру перед ее длительным хранением, L-индуцирующее действие пенициллина проявляется через год в субкультуре ° В предшествующей культуре на среде

Китта-Тароцци L-формы под воздействием пенициллина тотчас не образовывались, так как L-формы бледной трепонемы на жидкой питательной среде не образуются, но воздействие пенициллина таким образом сказалось на культуре, что она при пересеве ее через год на среду, оптимальную для образования Ь-форм, стала Расти в виде L-форм, Бледная трепонема превратилась в L-формы в результате феномена L-постиндукции, т,е, индукции L-форм, наступившей спустя длительное время (через год) в культуре поколения, следующего за предшествующим, подвергшимся воздействию пенициллином в условиях, не оптимальных для превращения бледной трепонемы в L-формы, 721489

5 Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Е. Корина Техред И.Асталош Корректор Е, Папп

Закаэ 84/23 ° Тираж 522 . Подписное

ПНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 диной сыворотки, 0,05Ъ МдБОд и 10% сахарозы, среду заливают вазелином и инкубируюг в термостате при 37 С, На 4-й день появляются первые признаки видимого роста, морфология культуры обычная. В среду добавляют пенициллин из расчета 500 ЕД/мл среды и посевы инкубируют в гермостате

7 дней ° На 7-й день в культуре обна. руживают цисты, зерна, шаровидные элементы. Культуру пересевают на

0,3%-ный агар на основе пептона

Мартена с 20Ъ нормальной лошадиной сыворотки, 2% номальной сыворотки морской свинки 0,05% М БО 10% сахарозы. Посевы инкубируют в термостате при 37 С. На 14-й день появляются первые признаки видимого роста в виде легкого помутнения среды и огдельных колоний. При микроскопии обнаруживают трепонемы и реверсирующие L -элементы, В культуру вносят пенициллин из расчета

1000 ЕД/мл среды, В течение 15-20 дней после внесения антибиотика под .микроскопом наблюдают интенсивный процесс L-трансформации, в результате которого вся культура превращается в L-формы, L-Формы продолжают инкубировать в термостате при 37 С и на 60-и день после pocesa обнаружи« вают вторичный рост, обусловленный реверсией L-формы. Культуру вторичного роста снова перрсевают на среду Китта-Тароцци с 0,05% M SO и

10% сахнроэы и далее пассируют, как описано, более 30 раз.

1, Способ культивирования Ь-форм Эгеропета раИ!сЬяп путем пассирования культур L-форм на питательных средах в присутствии постепенно воэрастаощих концентраций пенициллина . и инкубированием посевов, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью длительного поддержания культуры в

L-форме, проводят пассаж на жидкую, питательную среду, после инкубирования пересевают на полужидкую питательную среду, посев инкубируют до появления вторичного роста культуры затем пересевают на жидкую питатель20 ную среду, причем пенициллин вводят в питательную среду в каждом пассаже при появлении первых признаков роста.

2. Способ пр п. 1, о т л и ч а ю25 шийся тем, что концентрацию пенициллина от пассажа к пассажу повы-. шают до 4000 ЕД/мл.

Источники информации, Я принятые во внимание при экспертизе

1. Антибиотики, 11, 1974, с. 998-1003.