Способ получения -лизина

Способ получения -лизина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

г

О П И (, "А Н И Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТ У

Союз Советскик

С оцивлнетичесимгг

Республик

<гг>722492 (6I) Дополнительный к патенту .— (22) 3айв лево 06.08.74 (21) 2054466/28-13 (З) ПДио титет — (32) 07.08.73 (53) М. Кл.

С 12 D 13/06

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытий (3 () 89135/19 73 (33) ЯпониЯ

Опубликовано 150386 Бюллетень М 10

Дата опубликования олисаиий 1503,80 (гзЯ) УДК 668, 394 (088. 8) Иностранцы (72) Авторы Тутому Танака, Тамоцу Хиракава и Кендзи Такахара изобретений (Япония) Иностранная фирма Канегафучи Кемикал Индастриз Ко, ЛТЛ (Япония) l

PN) Заявитель (54) CnOcos ПОПУ (ИИЯ 1,-m3HHA

Изобретение относится к технике получения L-лизина ферментацней микроорганизмов в культураль ной среде, содержащей источник ассимилируемого микроорганизмом углерода, и может быть использовано в производстве кормов, пищевых продуктов и фармацевтических препаратов.

Известен способ получения L-лизина путем выращивания продуцирующих

его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода,. азота, неорганические соединения н стимуляторы роста с последующим выделением 1.-лизина из культуральной жидкости одним иэ известных способов, например, при помощи ионообменнЫх сглол (1) . Известный способ не обеспечивает высокого выхода L-лизина.

Целью изобретения является увеличение выхода L-лизина, а также получение лизина иэ углеводородов, как источника углерода, путем культивирования мутанта штамма микроорганизма, принадлежащего к роду Acinetobacter.

Это достигается тем, что в предлагаемом способе получения L-лизина в качестве микробрганиэмов-продуцентов используют мутантные штаммы

Acinetobacter caIcoaceticus АТСС

31024, ОТСС 31025 и АТСС 31028, полученные из штамма Acinetobacter

caIcoaceticus Р 38 ATCC 31023 предпочтительно ультрафиолетовым облучением.

При этом штаммы являются устойчивыми в среде к более чем 0,05% L-треонина и L-валина, или более чем

0,05% L-валина.

Крогле того, штаммы являются устойчивыми к аминокислотам или их аналогам, к комбинации аминокислот и их аналогов, при этом аминокислоты вы бирают из группы, включающей треонии, валин, метионин, лизин и серии, а аналоги аминокислот выбирают из группы, включающей норвалин, р -оксивалин, г- -аминомасляную кислоту, d -амино- р -хлормасляную кислоту, Я-аминоэтилцистеин, гидроокись лизина, гидроокись серина, гидроокись метионина и гидроокись валина.

При этом в качестве стимулятора роста L-лизина используют поверхностно-активное вещество.

Способ осуществляют следующим образом.

Продуцирующие L-лизин микроорганизмы, в качестве которых используют

72.2493 мутантные штаммы Ас1пеФobacter

caIcoaceticus АТСС 31024, ATCC 31025 и ATCC 31028, полученные из штамма

Acinetobacter caIcoaceticus Р 38 ATCC

31023 ультрафиолетовым облучением, выращивают на ггитательной среде, содержащей источники углерода, азота, неорганические соли и стимуляторы роста.

Культура Acinetobacter caIcoaceticus Р 38 может быть также обработана таким мутагенным агентом, как нитрозогуанидин (N-метил-N-нитро-Nг

-нитрозогуанидин) или производным изотиоциановой кислоты или подвергнута адаптации.

Адаптацию проводят путем культивирования родственных видов в культуральной среде, содержагггей специфические алгиггог<ггслотьг или аналоги аминог<ислот, илгг нх комбинации, такие аминокислоты, каг< например, треонин, валин, метионин, серии,лизин, или такие аналоги аминокислот, каг< р -гидроксинорвалин, < -аминомасляная кислота, г-амино- г. -хлормасляная кислота S-ами<

"Ъ < ноэтилцистеин, гидроокиси лизина, серина, метионина и эалигга.

B качестве стимулятора роста

-лизина используют поверхностно-активное вещество, например полиоксиэтиленсорбитантриолет ТВИН от 0,01 до 0,5% 30 в расчете на обгцее количество культуральной среды.

Полученную культуру разбавляют соответствуюгяггм образом, наносят ее на агар чашки Петри и культивируют Я штамм в течение 3-5 дней. B качестве источников углерода используют н-парафин, органические кислоты, этанол и т.п. устойчивый к аминокислотам или их аналогам штамм подвергагат далее мутагенной обработке или адаптации с применением других аминокислот, их аналогов или комбинаций для придаггия устой:"ивости против них.

Штаммы являются устойчивыми в сре- "з де к более чем 0,05% L-треонина и

Ь-валина,,или более чем 0,05Ъ 1,-валина

Штаммы являются устойчивыми к аминокислотам или их аналогам, к комби- 5О нации аминокислот или к комбинациям аминокислот и их аналогов, Полученный штамм образует 1 -лизин при аэробной культивации с применением н-парафинов, содержащих от 10 до 20 атомов углерода в линейной цепи, например керосин, газойль и т.п. Эти источники углерода применяют г<аждый в отдельности или в комбинации из двух или более, В качестве источников азота используют органические и неорганические аммонийные соли, такие, как сульфат аммония„ хлористый аммоний, нитрат аммония, ацетат аммония, сукцинат аммония, мочеэину, аммиак.

В качестве неорганических солей используют фасфат калия, натрия, сульфат магния, железа, марганца, цинка, карбонат кальция и r.u. в количестве, обычно применяемом в гроцессах ферментации.

Показатель рН культуральной среди эа весь период культивирования подцерживают от 5,5 до 9,0, предпочтительно от 6,0 до 8,0, путем добавления ионов аммония.

Культивирование проводят при температуре .от 25до 40 С, предпочтительно от 30 до 37О С, в аэробных условиях, например, при перемешив анни с аэ рацией или путем взбалтывания.

По окончании культивирования образовавшиеся клетки извлекают из культуральной среды„ например, фильтрованием или центрифугироэанием, при помощи ионообменных смол. В качестве ионообменных смол используют, например,амберлит ХВС-84, IRC 120, 1НС

50. Ионообменную смолу затем элюируют эодггыч аммиаком, элюат концентрируют и нейтрализуют концентрированной соляной кислотой.

Выделенный хлористоводородный лизин высушивают, получая продукт чистотой более 98%. I р и м е р 1. Взятый петлей платиновой проволоки посевной материал Acinetobacter sp Р 38(АТСС

31023) и родственные ему мутантные штаммы Ас1пе оЬас ег sp 938-15 (ATCC

024), Acinetobacter sp У 38-?О (АТСС 31025) и Ас1пеtobacter sp

Р 38-20 (АТСС 31028) засевают в пробирку, содержащую 10 мл культуральной среды, состава, t: пептон 1, мясной экстракт 1, дрожжевой экстракт 0,5. Среду предварительно стерилизуют в течение 15 мин при 120< С.

Культивирование производят в течение 24 ч при 38 С для получения посевной культуры. Две капли этой культуры вносят в 10 мл среды пробирки и культивируют затем при

33 С.

1. Культуральная среда (контроль) содержит 15 мл этанола, 12 мл 75Ъной фосфорной кислоты, 6 r сульфата аммония, а также содержит, мг:

MgSO> 7Н О 200; FeSO4 ° 7Н О 100;

CaCI> ° 2Н О 100; ZnSO4 7Н -О 30;

NnSO< ° 4Н О 2; CuSO ° 5Н О О, 5;

NaOH 10 г водопроводная вода 1 л.

2, Среда, содержащая треонин, Контрольная среда плюс 0,5 г/л треонина.

3. Среда, содержащая валин.

Контрольная среда плюс 0,5 г/л валина.

Среды стерилизуют при 120 С в течение 15 мин перед посевом, Данные роста штаммоэ в каждой среде приведены в таблице.

Результаты таблицы показывают, что после 20 ч культивирования

722492 штамм 938-15 устойчив к треонину и валину и штаммы 9938-19 и 38-20 устойчивы к валину.

Каждый из четырех штаммов засевают в косую среду, содержащую н-парафины и соли, имеющую следующий состав, Ъ: н-С, - С,я-парафины

0,8; сульфат аммония 0,6; К НРО 1,0;

М9$04 7Н10 Gg02i Кнар04 1/0; NaCI

О, 1; Fe$04 7Н О О, 1; Zn$04 ° 7Н О

0,003; MnS04 4Н О 0,0003; агар 2;

CaC1 H 0

Культивирование проводят 2 дня при 33 С, рН 7,0, стерилизуют при

120 С в течение 15 мин.

Взятую петлей платиновой проволоки эту культуру засевают в 20 мл указанной среды, содержащейся в колбе Сакагучи на 500 мл и культивируют при 33 С в течение 10 дней.

Среда для получения Ь-лизина имеет следующий состав, Ъ: н-С, -С, — Щ

-парафины 10; К НР04 0,05; КН РО

0,605; MgSÎ ° 7Н О 0,05, FeS04 7Н О

О 001 ZnSO4 ° 7H O О, 001; МпБО» ° 4H O

0,001, ТВИН 85 0,11 СаСО> 3; (НН4)> SQ

3 5. 25

Стерилизуют при 120"С в течение

15 мин.

По окончании культивирования содержание хлористоводородного L-лизина определяют микробиолОгической 3() пробой, получая следующие данные:

Применявшийся Количество штамм, лизина, Р г/л

38

0,4

38-15

20,4

38-19 21,4

38-20 1,1

Пример 2. Штамм М 38-15 предварительно культивируют со взбалтыванием в среде из н-парафинов и неорганических солей косой культуры, как описано в примере 1, в течение 2 дней при 33 C...Взятую петлей .платиновой проволоки эту культуру засевают в 30 мл указанной среды, содержащейся в колбе Сакагучи, на

500 мл, и затем культивируют со вэбалтыванйем при 33ОС один день.

Среда посевной культуры имеет состав, %: н-Cä — С 8 -парафин 2;

75%-ная фосфорная кислота 1,2 (po обЪему) 1 (NH4)< $04 О, 6; NaCI О, 1, MgSO4 7Н40 0,02; CaCI ° 2Н О 9,01.; 55

FeSO4. 7Н О 0,01; Zn$04 ° 7Н О О, 003;

MnS04 ° 4Н О О, 0002; ТВИН 85 0,05;

КОН 1,4.

Стерилизуют при 120 С в течение

15 мин. 60

5 мл получившейся посевной культуры переводят в 200 мл среды, имеющей такой же состав и содержащейся в колбе Сакагучи на 2 л, и культивирование со взбалтыванием 65 продолжают один день при 33"C. Затем

600 мл посевной культуры вносят в 19 л указанной ниже среды для получения L-лизина, содержащейся в ферментере на 30 л, и культивируют при взбалтывании, аэрировании со скоростью 27 л/мин, перемешивании при 500 об/мин, рН от 5 до 8 поддерживают водным аммиаком в течение

72 ч.

Среда для получения -лизина имеет следующий состав, Ъ: н-C С,4-парафин 10; К НРОц 0,05; КН РО

0,04 1 Mg$04 ° 7Н О О, 05; Fe$04 ° 7H O

0gÎÎ1 ZnSO4 ° 7Н40 0/001 Мп$04 ° 4Н О

0,001; ТВИН 85 0,1; (NH4) $04 2;

СаСО

Стерилизуют при 120 С в течение

15 мин.

Количество образовавшегося L-лизина составляет 22 г/л культуральной среды. Затем 2 л этой среды центрифугируют для выделения клеток, отделенную жидкость пропускают через колонку с ионообменной средой Амберлит IRC — 84, адсорбируя Ь-лизин на смоле. Колонку промывают водой и

L-лизин элюируют разбавленным водным аммиаком.. Элюат концентрируют. рН доводят до 5,5 концентрированной соляной кислотой и после сушки получают 37,9 r хлористоводородного

L-лизина, имеющего чистоту более

98% .

Пример 3. Взятую петлей платиновой проволоки бульонную косую культуру Acinetobacter sp У 38-15, которую перед этим культивируют в течение 2 дней при 33 С, используют для посева в 20 мл среды в колбу

Сакагучи на 500 мл.

Затем штамм культивируют при 33 С

4 дня на среде следующего состава,%: этанол (подаваемый порциями) 5;

К НРО О, 1; КН РО ° О, 1; Mg$04 ° 7Н О

О, 05; FeS04.7Н О О, 001; 2п$0д ° 7Н О

0,001; Мп$04 ° 4Н О О, 001; ТВИН 85

0,1; СаС0 1; (ИЙ» )> S0„1.

Стерилизуют при 120 С в течение

15 мин.

По окончании культивирования определяют, что культуральная среда содержит 4,1 г L-лизина на 1 л.

Пример 4. Штамм Acinetobacter sp Р 38-15 культивируют, как описано в примере 3, но в качестве источника углерода в среде используют вместо этанола уксусную кислоту.

Микробиологическая проба показывает, что количество L-лизина составляет 3,7 г на 1 л культуральной среды.

Предлагаемый способ получения

L-лизина по сравнению с известным обеспечивает повышенный выход

Ь-лизина и может быть использован для его промышленного получения.

Контрольная

Контрольная+

+ треониновая

Контрольная +

Ф валиновая

Контрольная +

+ треониновая

Контрольная +

+ валиновая

Формула изобретения

Составитель A. Бражников а

Техред И.Петко Корректор В ° БУT«a

Редактор Л.Новожилова

Заказ 169/47 Тираж 522 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москвар Ж 35р 1аушская наб., д. 4/5 филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1.Способ получения L-лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, неорганические соединения н стимуляторы роста с последующим выделением L -лизина из культуральной жидкости одним иэ известных способов, предпочтительно при помощи ионообменных смол, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода лизина, в качестве микро-: организмов-продуцентов используют мутантные штаммы Acinetobacter caIcoaceticuS ATCC 31024, ATCC 31025 и АТСС

31028, полученные иэ штамма Acinetobacter caIcoaceticus 9 38 ATCC 31023 предпочтительно ультрафиолетовым 4О облучением.

Способ по п.1,. о т л и ч а ю щ и Й С я тем, что штаммы являются уотОЯЧивыми в среде к более чем C„0:54 .@

L-треонина и Ъ-валина, или более чем 0 05 L-валина

3. Способ пр п.1, о т л и ч а ю— шийся тем„ что штаммы являются устойчивыми к аминокислотам или их ,аналогам, к комбинации аминокислот, или комбинации аминокислот и их аналогов, при этом аминокислоты выбирают из группы, включающей треонин, валин, метионин, лизин и серин, а аналоги аминокислот выбирают из группы, включающей норвалин, б -оксивалин, А -аминомасляная кислота, А -амино- р -хлормасляная кислота, S-аминоэтилцистеин, гидроокись лизина, гидроокись серина, гидроокись метионина и гидроокись валина.

4. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве стимулятора роста Ь-лизина используют поверхностно-активное вещество.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент СССР 9266649 кл.

C 12 D 13/16, опублик, 1970.