Способ получения иммобилизованных биологических активных веществ

Способ получения иммобилизованных биологических активных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Сов:тскин

Социалистических

Республик д

) (61) Дополнительный к патенту (22} Заявлено 27.02.74 (Я1} 2003172/28 — 13

2 (51} М. Кл.

С 12 В 13/10

А 61 К 47/00 (23) Приоритет — (32) 28,02.73

Государстоенюй номнтет

ССДР по делам нзобретеннй н открытий (31) С1 — 1346 (ЗЗ) BHP

Опубликовано 25,03.80. Бюллетень № 11

Дата опубликования описания 25.0380 (53) УДК 616-089. .22 (088.8) Иностранцы

Ласло Баткай, Иштван Хорват, Ева Хорват, Ласло Борошш и Валентина П. Ли (ВНР}

Иностранное предприятие

"Хиноин Льедьсер еш Ведьесети Термекек Льяра PT (BHP) (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (541 СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

БИОЛОГИЧЕСКИ. АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Изобретение относится к фармацевтической промьпцленности и касается получения лекарственных препаратов HR инертных носителях.

Известен способ получения иммобилизованных биологически активных веществ путем ковалентного связывания биологически активного вещества с носителем-сополимером на основе жтгидрида а-Р-ненасыщенной дикарбоновой кислоты с последующим отделением и промывкой целевого продукта 111. 10

Однако такой способ не позволяет получить целевой продукт с высокой активностью.

Целью изобретения является повышение актйвности целевого п1тодукта.

Это достигается тем, что в качестве носите- 15 ля используют тройной сополимер ангидрида а+ненасыщенной дикарбоновой кислоты, винильного или дивинильного мономера и винилкарбоновой кислоты, причем мономер и винилкарбоновую кислоту берут в соотношении ф) (1-4}:1, а ковалентное связывание осуществляют в волной среде при рН 5,0-9,0 с постепенным щелочным гидролизом ангидридных групп.

Кроме того, в качестве ангидрида о-Р-нена"сыщенной дикарбоновой кислоты используют +.. эа ангидрид малеиновый, цитраконовой или итаконовой кислоты,,в качестве винильного нли дивинильного мономера используют стирол или метилстирол и в качестве винилкарбоновой кислоты — метакриловую или акриловую кислоту.

Способ осуществляют следующим образом.

Сначала проводят подготовку сополимсров, для этого мономеры, смешанные в соответствующих соотношениях при 80 С в течение 3 ч, доводят до реакции в 3,5 весл. толуола, а затем выдерживают в течение последующих

3 ч при этой же температуре. Полученный полимер отфильтровывают и сушат при 110 С в течение 20 ч, после чего его размалывают и просеивают.

В 20 мл 0,1 М буферного раствора фосфа-. та рН 7,5 при +4 C при охлаждении растворяют 1 г фермента и подмешивают 1 г полимера, причем поддерживают рН 7,5, добавляя

0,3 М раствора .гидроокиси аммония. Полное протекание реакции требует примерно 6 ч.

3а это время расходуется 14 мл 0,3 М раствора гидроокиси аммония. Набухшая смола, с которой связан фермент, представляет собой

724088

4 ,Трипсин;. 1 г х 9000 Е/г

1 промывная жидкость:

20 мл х 87 Е/мл

I I промывная жидкость., 40 мл х 12 Е/мл

II I промывная жидкость.

40 мл х 9 Е/мл

9000Е!

740 Е

480 Е

360 Е

15

52 F

30

40

50

3 эластичный гель. его отфильтровывают, промывают 20 мл 0,1 М буферного раствора фосфата рН 7,5, затем дважды по 20 мл М раствора NaCI и в заключение дважды по

20 мл дистиллированной воды. Измеряют объем и активность промывной жидкости, У трипсина активность определяют на основе -активности эстеразы, причем в качестве субстрата этиловый эфир бензол- L-аргинина. Измерение ведут рН-метрическим методом.

При определении пеницилинацилазы в качестве субстрата применяют G-пеницилин.

Единицы активности ферментов. Трипсин: ! E — количество, которое при 26 C и рН 7,8 в течение 1 мин разлагает 1 ммоль субстрата.

Пеницилинацилаэа: 1 E — количество, которое при 37 С и рН 7,5 в течение 1 мин разлагает

1 ммоль субстрата.

Пример 1. 49 г ангидрида малеиновой кислоты, 78 r стирола, 21,5 r метакриловой кислоты, 0,47 г 63%-ного дивинилбензола и

1,77 г йерекиси бенэола размешивают в течение

3 ч при 80 С в 382 г толуола, после чего выдерживают еще 3 ч при этой температуре. Образовавшийся полимер отфильтровывают, сушат при 110 С в течение 20 ч, а затем раэмалывают и просеивают.

Пример 2. Операции те же, что в примере 1, но.вместо стирола используют 885 г метилстиро па.

Пример 3. 56,05 ангидрида итаконовой, кислоты, 78 r стирола, 21,5 г метакриловой кислоты, 0,75 г дивинилбензола и 1,8 г перекиси бенэоила размешивают в течение 3 ч при 80 С в 400 r толуола. Полученный полимер отфильтровывают, сушат в течение 20 ч, при 110 Ñ, а затем размалывают и просеивают.

Пример 4. 1 r триксина (дважды перекристаллизованного, активность 9000 Eg/г) растворяют в 20 мл О,l М буферного раствора фосфата рН 7,5, а затем при +4 С добавляют

1 r сополимера, полученного по примеру 1, Добавкой небольших количеств 0,3 М раствора гидроокиси аммония поддерживают рН при постоянном значении, равном 7,5. По истечении 6 ч после добавки 14 мл 0,3 М раствора гидроокиси аммония значение рН остается постоянным, значит гицролиз прошел полностью.

Смола в этот период времени непрерывно набухала и к концу поглотила все количество жидкости.

После этого из сополимера путем промывки удаляют не связанный фермент.

Измеряют активность йромывной жидкости.

1 промывная жидкость. 20 мл 0,1 М буферного раствора фосфата, рН 7 5; II npo/ мывная жидкость: 2х20 мл 1 М раствора NaCI;

Ill промывная жидкость. 2х20 мл дистиллированной воды.

2680 Е

Вес нерастворимого фермента 1724 мг. Удель ная активность нерастворимого фермента

3700 Е/г.

1I р и м е р 5. Операции те же, что в примере 4, но в качестве фермента используют

1 г пеницилинацилазы с удельной активностью

4400 Е/r.

Пен ицил инацилаза:

1 г х 4400 Е/г 4400 Е

1 промывная жидкость:

20 мл х 40 Е/мл 800 Е

I I промывная жидкость:

40 мл х 1,3 Е/мл

I II промывная жидкость:

40 мл х 0,5 Е/мл 20 Е

872 Е/г

Вес нерастворимого фермента 181 мг.

Удельная активность нерастворимого фермента

1815 Е/г.

Пример 6. Операции те же, что в примере 4, но испольэуют 1 г сополимера, полученного по примеру 2. Вес нерастворимого фермента 532 мг. Активность нерастворимого фермента 3067,Е/г.

Пример 7. Операции те же, что в примере 4, но применяют 1 г сополимера, полученного по примеру 5 Вес нерастворимого фермента 1478 мг. Удельная активность нерастворимого фермента 874 Е/г, Пример 8. Операции те же, что в примере 4, но сочетают 1 r L-аргинина. Вес комплекса L-аргинин-сополимер !632 мг.

Пример 9. Г сополимером связывают ! г L-лизина, как это описано в примере 4.

Вес комплекса -лизин-сополимер 1592 мг., Пример IO. C сополимером связывают

I г глюкозамина, как это описано в примере 4.

Вес комплекса глюкозамин-сополимер 16! 1 мг.

Пример 11. С сополимером связывают ! г пнридоксалин-гидрохлорида, как это описано в примере 4. Вес комплекса пиридоксалиндигидрохлорид-сополимер 1724 мг.

Пример 12. С сополимером связывают

1 кг п-аминофенилацетата ртути, как это описано в примере 4. Вес комплекса и-аминофенилацетат ртути — сополимер 20 1 мг.

Предлагаемый способ позволяет получить целевой продукт с повышенной активностью

5 724088

Формула изобретения

6 ное связывание осуществляют в водной среде при рН 5,0 — 9,0 с постепенным щелочным гидролизом ангидридиых групп.

2. Способ тю п. 1, о т л и ч а ю ш и йс я тем, что в качестве ангидрида а+ненасышенной дикарбоновой кислоты используют ангйдрид маленковой, цитраконовой или итаконовой кислоты, в качестве винильного или дивннильного мономера используют стирол или метилстирол и в качестве винилкарбоновой кислоты — метакриловую или акриловую кислоту.

Составитель С. Малютина

Техред М.Келемеш

Корректор E. Папп

Редактор Т, Смирнова

Тираж 522 Подписное

11НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 479/46

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

I. Способ получения иммобилизованных биологически активных вешеств путем ковалентного связывания биологически активного вещества с носителем-сополимером на основе ангидрида а+ненасыщенной дикарбоновой кислоты с последуюшим отделением и промывкой целевого продукта„о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения активности целе- l0 вого продукта, в качестве носителя используют тройной сополимер ангидрида а+ненасьпценной дикарбоновой кислоты, винильного или дивиннльного мономера и винилкарбоновой кислоты, причем мономер и винилкарбоновую кислоту берут в соотношении (1 — 4):1, а ковалентИсточники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Бельгии Р 763382, кл. С 08 F, 1971.