Способ получения иммобилизированного фермента

Способ получения иммобилизированного фермента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

) I е

«iI 724513

Ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕ Н И Я

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт; свид-ву = (22) Заявлено 04.05.76 (21) 2357633 23-04 с присоединением заявок № 2375108/23-04;

2393356/23-04;

2393820/23-04 (51) N.Êë. .C 07 О 7/02

Гесудерстееиный комитет ссср ав делам иаебретений, и аткрытий! (43) Опубликовано 30:03.80. Бюллетень № 12 (23) Приоритет—

Ф (53) УДК 577.15Л17 (088.8) (45) Дата опубликования описания 30.03.80 (72) Авторы изобретен ни 10. Ю. Кулис, В.-С. А. Лауринавичюс и А. А. Малинаускас

1 (71) Заявитель Институт биохимии АН Литовской ССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ИММОБИЛИЗОВАН НОГО ФЕРМЕНТА

I (. !

1

*Изобретение относится к области энзи- кие как силохрбм, перлит, микрозил, силя- мологии, а й(менно к йолучению =,иммобили- кагель. зованных ферментов... В качестве апротонного растворителя исИзвестен способ получений иммобилизо- пользуют ацетон. или сульфолан. ванного фермента, вклвчайяций предвари- 5 Пример 1. 100 мг свежепереосаждентельную активацию носителя органической ного высушенного капрона размешивают в иди неорганической природы солями пере- " течен1ие 10 — 20 мин в 7,5 мл абсолютного ходных металлов с последующим койтакти - " ацетойа; добавляют 7,5 мл 3%-ного четырованием активированного" HocHTeлй с "вод- реххлористого титана в ацетоне или 10%ным раствором фермента 11).. 10 ного раствора четыреххлористого олова в

Однако известный способ не обеспечи- ацетоне, перемешивают в течение 1 — 5 мин, вает высокий коэффициент связываниф фер- и выдерживают 30 — 40 мин. Носитель отмента и, кроме того, получаемый .иммоби- фильтровывают, промывают 10 — 20 мл ацелизованный фермент не обладает термичес- тона и переносят в 5 мл раствора а-химокой стабильностью и стабильностью в раст- .15 трипсина, содержащего 15 мг фермента в ворах электролитов и денатурирующих - " 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,5) . Смесь агентов, например мочевины. . перемешивают 10 — 20 мин и выдерживают

Целью изобретения является устранение . при 2 — 5 С в течение 18 — 22 ч. Полученный указанйых недостатков., ... иммобилизованный фермент отфильтровыПоставленная цель достигается" тем Фго 20 вают, промывают 300 — 500 мл. 0,1 М фосв качестве растворителя солей металлов ис- - фатного буфера (ipH=7,5) и 300 — 500 мл.

--- =- пользуют aIIpотонпый растворитель, а, про- 1 М раствора хлористого калия. Количестцесс иммобилизации проводят при" ней- во иммобилизованного фермента равно тральных зйачениях рН.. 30,4 мг/г носителя в случае применейи e- . - 25

В качестве солеи металла используют" тыреххлористого титана и 5;4 мгlг носителя соли переходных металлов или алйминия, в случае четътреххлорйстого oJIoBB. а в качестве носителя применяются йоли- - Пример 2. 100 мг свежепереосаждеимеры, так не как капрон; поливинилхлорид, " ного высушенного капрона размешивают в рокристаллическая целлюлозй""ййИ вью =""течеййе" 10 — 20 мин в 7,5 мл абсолютного сокопбристые неорганические"вещества, та-" Ж ацетона, добавляют,7,5 мл 3%-ного четътЮ

Г» ф%

724513

hхh

4./

o > л о о хо ю е

Е» !

- O 4 о о х

4 о—

M cn w e х х

<О а о х о

Активность фермента, о.

o q

gl ( о

a3 cg а х х о

o .

o q х о»

М

С.

Д

Я

Ф

Ф. о

Остаточна я активность от нативного фермента, о а о .е,м

Ы СО » аб о хи

Способ

Ф о х ах

7,!

3,6

90,0

Известный

-16,2

57,7

0 16,6

Предлагаемый

92,3. 8,6

71,4

4,3 !

* В качестве носителя в обоих способах" исюльзовали целлюлозу; а" актинацию его осуществляли SnC14.

Установлено; чтопри инкубировании ям- 35 мобйлизованных. ферментов, получаемых

" ггри указанных выше условиях известным и предлагаемым способамй; — при температуре

65 С и рН 5,8 стабильность последних в 2,7 микрокристаллическую

Т аблица 2

Количество связанного белка, мг/г

Концентрация

КС1, м и редлагаеизвестный способ мый

4,2

3,6

3,4

3,1

3,2

3,6

3,! 3,1

3,5

3,3

:2,8

2,1

2,1

1,9

1,8

1,6

0,5

1,5

2,5

3,5 раза выше.

45 3 — "реххлористого титана в ацетоне или 10%Фго рМсгво»р»а»четйреххлористбго "олова в ацетоне, перемешивают 1 — 5 мин и выдерживают 30 — 40 мин. Носитель отфильтровывают, промывают 10 — 20 мл ацетона и 5 переносят в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 5,5 мг глюкозооксидазы.

Смесь перемешивают .10 — 20 мин и выдерживают 18 ч при 2 — 5 С. Полученный иммобилизованный препарат отфилйтровыва-: 10 от, "промывают 500 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора (pH=7,5),и 400 мл

0,1 М хлористого калия. Количест»во иммобилизованного фермента равно 1,2 мгlг носителя и 2,5 мг/г носителя соответственно 15

"" для" ч»етыреХхлористого олова и четыреххлористого титана .

Пример 3. 100 мг одного из высоко"пор истых неорганических носителей сило"- -хрома, перелита, микрозила илй силикагеля размешивают магнитной мешалкой в 7,5 мг абсолютного сульфолана в течение 15 мин, лосле чего добавляют 7,5 мл 10%-ного раст.".аора трехбромистого алюминия в сульфо.лане. Смесь перемешивают 3 мйн и вы- 25 .одерживают 30 — 40 мин. Обработайный таким образом носитель фильтруют; промывают 20 мл абсолютного сульфолана и переносят в 6 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с рН=7,5, содержащего 12 мг 30 трипсина. После этого смесь энергично пеейеш»»ив»ают и выдерживают при 4 С 20 ч. .Полученный иммобилизованныи фермент фильтруют, промывают 400 мл 0,1 М фосВ табл. 2 "приведены сравнительные свойства иммобилизованных ферментов при инкубированяи йх в растворах КС1 (pH

5,8), концентрация фермента 5 мг!мл. °

4 фатного буферного раствора с рН=7,5 и

400 мл 0,1 М хлористого калия. Количество иммобилизованного трипсина составляет

4,3 — 16,1 мг/г носителя.

Пример 4. 100 мг сйлохрома, перлита, микрозила или силикагеля .тщательно размешивают в 7,5 мл абсолютного ацетона 10 — 20 мин, после чего добавляют 7,5 мл

10%-ного раствора четь!реххлор истого олова в ацетоне ил и 4%-ного раствора четыреххлористого титана в ацетоне. Смесь перемешивают 1 — 5 мин и выдерживают

40 мин. Обработанный носитель фильтруют, . промывают 20 мл абсолютного ацетона и переносят в 6 мл фосфатного буферного раствора (pH=7,5), содержащего 12 мг тр ипсина. После этого смесь энергично перемешивают и выдерживают при темпера туре 5 G в течение 20 ч. Полученный иммобилизованный фермент фильтруют, промывают 400 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора и 500 мл 0,1 М хлористого калия.

Количество иммобилозованного трипсина составляет 4,3 — 16,1 мгlг носителя..

В табл . 1 представлены эффективность связывания фермента.и его свойства, полу-чаемые известным- и предлагаемым спосо- бами,.

Таблица 1

724513

Ф ор мула .изобретения.! р

Составитель Т; Шмелева Техред В. Серикова

Корректор С. Файн

Редактор Г. Прусова

Даказ 109/179 Изд. № 193 Тираж 497 - Подписное

НПО «11онск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открйтнй

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип. Харьк. фил. пред. «Патент» а 5

Аналогичная зависимость наблюдается при инкубировании иммобилизованных фер.ментов в растворах мочежины концентраций от 5,5 до 7,5 М, рН 5,8.

Применение указанного способа получе- 5 ния иммобилизованного фермента по срав-, нению с известнь1м позволяет увеличить коI личество связанного белка, повысить термост абильность фермента и увеличить его стабильность в растворах электролитов и де- 10 натурирующих агентов.

- 1. Способ полученця иммобилизованного фермента, включающий контактирование носителя с раствором соли -металла и последующим. контактированием его с водным раствором фермента., отличающийся

«

4 тем, что, с целью увеличения количества связанного фермейта и его стабильности, используют раствор соли металла в апро- тонном растворителе и контактирование с раствором фермента осуществляют при нейтральных значениях рН, 2. Способ по и. 1, отлич аю щийся тем, что в качестве солей металла используют соли алюминия, титана и олова.

3. Способ по пп. 1 и 2, отл и ч а.ющ и йс я тем, что в качестве апротонного растворителя используют ацетон или оульфолан.

Источник информации, принятый во внимание прйэкспертизе:

1. Патент Великобритании № 1346631, кл. С 07 G 7/02, опублик. 1975 (прототип).