Способ получения -рибулозо5-фосфата

Способ получения -рибулозо5-фосфата

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИС

ИЗОБР

К АВТОРСКОМУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

>727657 (61) Дополнительное (22) Заявлено 05Ä077 с присоединением эая (23) Приоритет

Опубликовано 15

Дата опубликован

)М. Кл.

С 07 Н 11/04//

A 61 К 29/ООГосударственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

3) УД (577 ° 154 ° .07(088.8) Н,Г. Русинова, Ле Тхи Лан Оань (СРВ) и Н.Г. Доман (72) Авторы изобретения

Ордена Ленина Институт биохимии им. A,Í. Баха (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 0-РИБУЛОЗО-5-ФОСФАТА

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения

D-рибулозо-5-Фосфата,который является ценным биохимическим реактивом.

Рибулозо-5-фосфат является субстратом уникального фермента цикла

Кальвина-фосфорибулокиназы.

Известен способ получения D-рибулоэо-5-фосфата путем ферментативного превращения D-рибозо-5-фосфата в присутствии высокоочищенной рибо-. зофосфатизомераэы, рыделенной иэ листьев шпината, и зпимеразы при

38 С с последующим выделением целевого продукта фракционированием эта- 15 иолом. Чистота продукта 30% (1) .

Недостатком известного способа получения D-рибулозо-5-фосфата являются многостадийность и сложность получения двух высокоочищенных фер- 20 ментов: рибозофосфатизомеразы и эпимераэы, а также невысокая чистота целевого продукта (30%) .

Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение качества целевого продукта.

Цель достигается использованием в качестве биокатализатора экстракта листьев Phaseo(us aureus, полученного при гомогенизации листьев в О, 05 М 36

2 трис-HCR . буфере с рН 7,0-7,1 в присутствии 0,2М NaCR, 0,005 М этилендиамин N, N, N, N-тетрауксусной кислоты (ЕДТА) и 0,1 М дитиотреитола и осуществлением ферментативного превращения при 62-65оС в течение 5-6 мин, что позволяет исключить из процесса высокоочищенные ферменты.

Способ получения D-рибулоэо-5-фосфата заключается в ферментативном превращении D-рибозо-5-фосфата в присутствии экстракта из листьев

Phaseout us auieus, полученного при гомогенизации листьев 0,05 М: трис-НСе буфером с рН 7,0-7,1 в присутствии

0,2 М NaCO, 0,005 М ЕДТА и 0,01 М дитиотреитола, при 62-65оС в течение 5-6 мин. Чистота целевого продукта в виде бариевой соли 79,6-83,2%.

Бариевая соль переводится в натриевую путем добавления к кислому раствору бариевой соли (рН 6,0-6,5) эквивалентного количества сульфата натрия с последующим быстрым замораживанием и высушиванием. Чистота натриевой соли 83%.

Пример 1 ° Получение рибулозо-5-фосфата натрия.

Выращивание Phaseo9us aureus производят на:почве или песке с добавле727657

Препарат мин ал

ый

D-Ри булозо-5- фос фат бариевая соль, 15,7 79,6

5,7

380 Мед/мг белка экстракта из листьев маша

340

13,8

3,0

83,2

D-Рибулозо- 2, 0

-5-фос фат натриевая соль

390 Мед/мг белка экстракта. из лист ьев маша

83,0

Осадок сульфата бария удаляют центриФугированием. Супернатант содержащий натриевую соль D-рибулозо-5-фосфата, быстро замораживают, высушивают сначала лиофильно, затем в вакуум-зксикаторе над Р<О> при 0-4 С.

Потери при переводе D-рйбулозо-540 -фосфата бариевая соль в D-рибулозо-5-фосфат натриевая соль составляют около 10%.

Результаты анализа полученного

О-. рибулозо5-фосфата.натриевая соль на содержание фосфора (в%) и фермен

Пример 2, Получение рибуло з о-5-фос фат а н атри я .

В качестве исходного вещества для получения натриевой соли D-рибулозо-5-фосфата используют бариевую соль D-рибулозо-5-фосфата. Рибулозо-5-фосфат бария растворяют в минимальном количестве бидистиллировано ной воды при 0-4 С. Полученный раствор доводят до рН 6,0-6,5 соляной кислотой и добавляют в него равное количество (по содержанию бария в

0-рибулозо-5-фос фате) мкмоль Ба ВО нием питательного раствора Пряниш- при 4 С. Осадок удаляют центрифуги никова в оранжерее в течение 2-3 нед рованием. Поверхностную жидкость при т. 15-30 С. о полученную после центрифугирования, Для получения экстракта листья нейтрализуют 0,5 í. NaOH до рН 6,0

-"двух- трех недельных растений гомо- и затем добавляют 20 мл уксуснокисгенизируют в течение 2 мин в 0,05 И лОго бария. Фракционирование D-рибутрис-HCQ буфере с рН 7, 0-.7,1 в лозо-5-фосфата производят 96%-ным . присутствии О, 2 М БаСЮ, 0,005 М этанолом. Выпал обильный осадок.ПосЕДТА и 0,01 M дитиотреитола. Гомэ- ле центрифугирования осадок собигенат фильтруют через 3 слоя марли, рают и высушивают лиофильно. Выход центрифугируют при 17000 g в тече- рибулозо-5-фосфата составил 57% или ние 30 мин. Поверхностную жидкость . 2800 мг. (экстракт) используют для фермен- . Состав ферментной смеси для протат ивного синтеза. верки активности фосфорибулокиназы в

Состав ферментной смеси для прев- присутствии полученного D-рибулозо-. ращения D-рибозо-5-фосфата в D-ри- -5-фосфата цистеинкарбазаловым мебулоэо-5-фосфат: тодом, мкмоль/мл ферментной смеси: трис-HCP. 0,005 М, Хлористый магний . 10 рН 7,1, мл 50 Дитиотреитол 2 дитиотреитол 5000, D-ри було зо-5-фо сфат 2 мкмоль . 5000 АТФ 3 экстракт (350-400 мг 30 трис-НС% 0,05 М, рН 7,9 40 белка); мл 65 Экстракт, содержащий ри бо зо -5- фос фат, белка, мг 0,5 мкмоль 10000 Результаты проверки ферментатив.Реакцию начинают добавлением в фер- ной активности, анализ полученного ментную смесь рибозо-5-фосфата. g5 D-рибулозо-5-фосфата на фосфор предРеакцию пр .эвбдЯт в течение 5-6 мин ставлены в таблице. Анализы показали нри 62-65 С. Белок ферментной смеси соответствие формуле осаждают 5%-ной трихлоруксусной С НдО P Ва 7Н О кислотой (конечная концентрация) С .НэОаР Na 5Щ)

Результаты анализа полученного D-рибулозо-5-фосфата в виде бариевой и натриевой солей на содержание фосфора,и ферментативную активность

727657

Составитель Л. Никулина

Техред М. Кузьма Корректор . С. Шекмар

Редактор Т. Дев ятко

Тираж 495 Подписное цНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.,открытий

113035, Москва, Ж-35, Раужская наб., д. 4/5

Заказ 1070/25

Филиал ППП ПаТент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 тативную активность представлены в таблице.

Результаты ферментативной проверки свидетельствуют о высоком качестве полученного препарата D-рибу лозо-5-фосфата натрия. Активность

D-рибулозо 5-фосфата в виде бариевой и натриевой солей при хранении (-20 С) не снижается в течение 6 мес.

Формула изобретения

СпОсоб получения D-рибулозо-5-фосфата путем ферментативного прев-. ращения D-рибозо-5-фосфата в присутствии биокатализатора при повышенной температуре с последующим выделением целевого продукта фракционированием этанолом, о т л и ч а юшийся;тем,что,. с целью упрощения процесса и улучшения качества целевого продукта, в качестве биока« тализатора используют экстракт листьев Phaseotus aureus, полученный при гомогенизации листьев в, 0,05 М. трис-HCQ буфере с рН 7.,0-7,1 в при« сутствии.,0,2„М, NaCC, 0,005 М этилендиамин N,N,N,N-тетрауксусной кислоты и 0,01 М дитиотреитола, и ферментативное превращение осуществляют при 62-65ОС в течение 5-6 мин.

Источники информации, принятые во внимание нри экспертизе

1. В.L. Horecker. Preparation,. and

analysis of r1buRose-5 hosphate,"Methods in Епгупю9оду", 3, с. 190192 (1957) (прототип).