Способ получения вакцины против гепатита в

Способ получения вакцины против гепатита в

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

@, яуот п,72872О

Союз Соаетсккз

Соцкалмстическкх

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 120376 (21) 2332953/28-13 (23) Приоритет — (32) 17. 11. 75 (51) М. Кл.

С 12 К 5/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (З) США (31) 631961 (53) УДК 615 ..372 (088. 8) Опубликовано 150480. Бюллетень № 14

Дата опубликования описания 150480 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Альфред МайеР ПРинс, Александер Роберт Ньюрат (США), Джон Внек (ЧССР) и Кристиан Трепо (Франция) Иностранная фирма

1 1

Дзе Коммьюнити Блад Каунсил оф Грейтер Нью-йорк, Инк (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В

15

30

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства бактерийных препаратов.

Известен способ получения вакцины против гепатита В путем выделения частиц HBsAg, содержащих е-антиген на частицах или в растворе, из плазмы крови носителей антигена гепатита В, содержащей е-антиген с последующей инактивацией целевого продукта (1) . Однако вакцина, полученная . известным способом, не обладает высокой специфичностью.

Целью изобретения является повышение специфичности вакцины.

Эта цель достигается тем, что плазму крови обрабатывают 3,04,5 вес.Ъ полиэтиленгликоля при РН

4,4-4,7, полученный осадок, содержащий HBsAg частицы размером 30-50 нм, растворяют при РН 4,9-5,1, затем

РН надосадочной жидкости доводят до 4,4-4,7, повторно обрабатывают полиэтиленгликолем и полученный осадок растворяют в физиологическом растворе.

Кроме того, целевой продукт инактивируют обработкой формалином или р -пропиолактоном или облучением рентгеновскими лучами.

Предлагаемым способом получают вакцину против вирусного гепатита, которая включает в свой состав антигенные частицы, имеющие размер частиц 20-50 нм, причем эти антигенные частицы содержат неосажденные свободные необъединенные гепатит р-поверхностные антигены. Вакцина имеет менее 10 единиц антител гепатит Р --поверхностного антигена на 1000 ед. гепатит -поверхностного антигена. 5Ъ частиц с размером, лежащим в интервале 3-50 нм, содержат неосажденные е-антигены или специфичные антигены, аналогичные частицы Дана. Антиген гепатита и е-антиген содержатся в вакцине в количестве, достаточном цля образования антител при введении нх в организм животного.

Для получения вакцины против гепатита В используют материал, состоящий из плазмы, полученной из хронического носителя, который содержит антигены. Такая плазма также содержит большое количество частиц Дана и волокон, не содержащих объединенного анти-е-антитела. Плазма может быть получена от клинически здоровых человеческих хронических носителей нВ, а также от шимпанзе, которых

728720 естественно или искусственно инфицировали вирусом HB и которые становились хроническими носителями е-антиген положительногo HBsAg.

Исходный материал должен быть бактериологически стерильным и должен быть свободным от присутствия адвентициальных вирусов.

Очистку проводят обычным способом.

Из антигенсодержащего вещества крови удаляют примеси путем подкисления до рН 4,4-4,7. Выпавший осадок вместе с клеточными остатками удаляют центрифугиронанием в течение

20 мин со скоростью 10000 об/мин.

После этого материал смешивают с

2,5-4,5 вес.Ъ полиэтиленгликоля, !

5 предпочтительно с 3,0-4,5 вес.Ъ. Более ни з кие концентрации, например

3-4Ъ, могут осаждать крупные формы частиц и поэтому при определенных обстоятельствах являются предпочти- 20 тельными. Весовой процент полиэтиленгликоля рассчитывают по отношению к общему весу смеси. Таким образом, осаждают антигенный материал, содержащий гепатит В с более крупным 25 размером частиц, например 30-50 нм, а также часть материала, содержащего оболочкоподобный гепатитный В поверхностный антиген. Осадок, содержащий

HBsAg, регенерируют, и добавляют некоторое количество воды при рН 4,9—

5,1. Образуется осадок, содержащий белковое вещество и полиэтиленгликоль, а жичкая фаза — надосадочная жидкость, содержащая HBsAg, содержит частицы Дана или волокнистое вещество, рН недостаточной жидкости доводят до 4,4-4,7. Затем ее смешивают с 3,0-4,5 нес.Ъ полиэтиленгликоля, считая на общий вес смеси, с образованием осадка, содержащего очищен- 40 ные частицы, содержащие HBsAg поверхностный антиген, имеющие оболочкооб.разную конфигурацию с размером частиц 20-30 нм и волокнистые частицы, содержащие HBsAg e-антиген, который не содержит какого-либо анти-е-антитела, причем волокнистые части— цы имеют диаметр 20-50 нм, а также частицы Дана со сферической конфигурацией, имеющие размер 40-50 нм и 50 имеющие липопротеиноную внешнюю сферу, содержащую HBsAg и е-антигены, а также содержащие сердцевину, включающую ДНК, ДНК полимеразу и HBsAg.

В результате регенерируют очищенный антигенный материал. После этого его обрабатывают с целью инактинации вируса, а полученный осадок растворяют в физиологическом растворе.

Температура каждой из смеси после Я каждой стадии смешивания поддержинают в интервале 0-80 С в ходе образоЯ вания осадков. Стадия очистки облегчается, если регенерацию усиливают в результате центрифугиронания с 65 последующими стадиями осаждения.

Полиэтиленгликоль используют н виде водного раствора, который содержит

30 вес.Ъ полиэтиленгликоля. Такой полиэтиленгликоль имеет мол. вес.

500-50000, предпочтительно около 6000.

Дальнейшую очистку осуществляют путем адсорбции очищенных антигенов на гидроксилаппатите с использованием хроматографии. Частично очищенные антигены пропускают через хроматографическую колонку, содержащую гидроксилапатит, на котором они адсорбируются. Дополнительно очищенные антигены затем регенерируют с использованием мчогоступенчатого элюирования. Частицы с размером 2550 нм регенерируются отдельно от фракций с частицами более мелкого размера (16-22 нм) и от основной массы сывороточных протеинов. После очистки фракция более крупных частиц может быть инфекционной. Для этого осуществляют инактивацию. Целевой продукт инактинируют обработкой формалином в концентрации 1:2000 в течение 4 дней при 37 С с использованием обычных методик или облучением рентгеновскими лучами. Вакцину осветляют путем фильтрации через

MiIIipore 0,22, фильтр или эквивалентный фильтр перед добавлением формалина или PJ -пропиолактона.

После инактивации конечный продукт подвергают диафильтрации с использованием Amicon РПЗО фильтра или эквивалентного фильтра против

0,9Ъ NaCI, содержащей 1:10000 ThiomerasaI и любой стабилизатор, для удаления низкомолекулярных соедине- ний, используемых для инактинации, затем стерильно фильтруют и соответствующим образом разливают в стерильные ампулы для модификации или замораживания, Вакцину используют на отсу".ствие инфекциозности, иммунологическую активность.

Вакцину можно применять путем подкожной или ннутримышечной инъекции. Применяют обычно около днух доз в месяц с последующим введением вспомогательного вещества н период от 6 мес. до 1 года после перничной иммунизации. Первоначальная дозировка зависит от веса организма, а последующие дозировки — в зависимости от уровня антител в крови после первоначальной иммунизации.

Использование получаемой вакцины против гепатита В предотвращает хроническое заболевание печени.

Пример 1. Очистка и определение НВ ассоциированных частиц из

7,8 л плазмы от одного шимпанзе-носителя HBsAg.

Вещества и методики. Источник

HBsAg.

Антиген очищают из объединенной плазмы носителя шимпанзе, преднари728720 тельно инокулирэванйого человеческой

HBsAg — положительной.плазмой, относящейся к adn подтипу. е-Антиген присутствует на поверхности способных к идентификации частиц Дана и используемой плазме.

Очистка HBsAg и е-антигена.

HBsAg и е-антиген выделяют из плазмы путем осаждения с помощью полиэтиленгликоля (PEG). Повторно суспендированный осадок HBsAg и е-антигена очищают хроматографированием на колонке с гидроксилапатитом. Конечные стадии очистки включают плотностное градиентное центрифугирование.

Осаждение HBsAg и е-антигена с помощью PEG.

На стадии, предшествующей очистке 7,800 мп HBsAg и на содержащей е-антигена плазмы, устанавливают рН 4,6 и добавляют ЗОЪ-ный раствор 2()

PEG в дистиллированной. воде до приблизительно 2Ъ концентрации. Раствор оставляют на ночь при 4 С и осветляют центрифугированием HBsAg во всплывшем слое, осаждают увеличением концентрации PEG до 4Ъ. Всплывший слой после стояния в течение ночи при 4 С декантируют и отбрасывают. Осадок

HBsAg (содержащий е- антиген) ресуспендируют до 500 мл в дистиллированной воде. Основную часть PEG с некоторыми примесями осаждают, устанавливая рН раствора равным 5,0 и осадок удаляют центрифугированием. Прозрачный верхний слой доводят до рН 4,6 и HBsAg и ассоциированный с частицей е-А HBsAg (e) осаждают в результате добавления ЗОЪ раствора

PEG до конечной концентрации 4Ъ.

HBsAg/е удаляют центрифугированием после стояния образца в течение но- 40 чи при 4 С. Наконец, осадок HBsAg/е о ресуспендируют до 320 мл в дистиллированной воде.

Хроматографирование на колонке с гидроксилапатитом. 44

50 мл ресуспендированного .PEG осадка HBsAg/å пропускают через колонку 6,5 X 16,5 с гидроксилапатитом и элюируют прерывистым градиентом фосфатного буфера. В следующем экс- 5{) перименте 200 мл образца подвергают частичной очистке на колонке

6,5 X 35 см с гидроксилапатитом.

HBsAg, элюированный совместно с первым протеиновым пиком, пропускают

55 через колонку с гидроксилапатитом во второй раз.

Плотностное градиентное центрифугирование.

Фракции HBsAg, выделенные хроматографированием на колонке, очищают 40 скоростным зональным центрифугированием. Прерывистый градиент получают при использовании 3 мл 60 Ъ и 7 мл

40Ъ сахарозы в 0,02 М натрийфосфатном буфере при рН 7,2 (содержащем

0,02Ъ NaHq) .

В каждую пробирку загружают по

20 мл образца и центрируют на Spinso

SW 25,1 роторе при 18000 об/мин в течениЕ. 18 ч.Фракции объемом 1!мл собирают по каплям со дна пробирок и анализируют на содержание НВздд, Фракции, содержащие максимальное количество антигенной активности, объединяют, тщательно диализируют и концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны с 30000 MW отжимным рантом (Амикон РМ-30) . -.Концентрированные фракции HBsAg подвергают конечным стадиям очистки изопикническим связыванием в линейном градиенте CsCI и скоростному зональному центрифугированию в прерывисТоМ градиенте сахарозы при обычно используемых условиях.

Методы детектирования.

3а содержанием HBsAg следят методом встречного электрофореза (CEP) или твердо-фазной радиоиммунопробой

Ausria 1 или II, Abbott Laboratories

Концентрацию протеина устанавливают при 280 нм с использованием микрометодики KjehIdahI

Критерий чистоты HBsAg.

Образцы после каждой стадии очистки анализируют методами целлюлозоацетатного электрофореза, иммуноэлектрофореза и испытаниями диффузии в системе агарового геля по отноше— нию к поливалентной аытинормальной человеческой плазмапротеиновой антисыворотке.

Полиакриламидный гелевый электрофорез.

Аликвоты образцов, содержащие

0,01 натрий фосфатный буфер при рН 7,2, 1Ъ натрий додецилсульфата, 1Ъ -меркаптоэтанола и 10Ъ глицерина, нагревают в течение 2 мин на кипящей водяной бане, обрабатывают 7,510Ъ найтрийдодецилсульфатакриламидными гелями.

Результаты очистки HBsAg/е положительных сывороток осаждением с помощью полиэтиленгликоля представлены в таблице. Около 87Ъ первоначального протеина плазмы удаляются на первой стадии осаждения HBsAg (которая включает предочистку при концентрации

PEG 2Ъ) . Конечный выход после двух последовательных стадий осаждения с помощью PEG лрказывает количественную регенерацию HBsAg в присутствии лишь

4Ъ первоначальных протеинов.

Очистка объединенного HBsAg шимпанзе осаждением с помощью PEG-6000.

728720

Образец

Ь и

Первоначальная

HBsAg-плазма

100

7,800 512

429,0

Первое осаждение

4% PEG

6,9

55,0

7,080

500

20 7

16 6 80

Второе осаждение

4% PEG 320 10 000

50 мл ресуспендированного PEG осадка НВэАу фракционируют хроматографированием на гидроксилапатите.

Элюат группируют на семь фракций, которые диализируют по сравнению с 0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азица.натрия) и концентрируют ультрафилы- 2О рацией. Концентрированные образцы анализируют на протеины при 280 нм и на присутствие HBsAg методом CEP.

200 мл ресуспендированного PEG осадка HBsAg Фракционируют на 1000 мл колонке с гидроксилапатитом. Фракции HBsAg из первого протеинового пика (группа 1: фракции 38-83) и оставшийся элюат (группа II фракции

84-110) объединяют и концентрируют до 75 мл ультрафильтрацией.

Концентрированный образец из группы 1 повторно хроматографируют на колонк объемом 1000 мл с гидроксилапатитом.

Элюат объединяют на восемь фракций. Объединенные образцы концентрируют ультрафильтрацией и промывают

0,02 М натрий-фосфатным буфером при рН 7,2 (содержащим 0,02% азида натрия) . Эти образцы анализируют на 40 протеин и HBsAG.

Анализ образцов на содержание примесей методом иммуноэлектрофореза обнаружил очень слабую линию преципитации во фракции I, более сильную линию во фракции ll — Vl и сильно выраженную широкую линию в объединенных фракциях Vl(-ЧИ), которые мигрируют между альфа и альбуминной областями °

Электронн ая микроскопия образцов обнаружила в основном сферические частицы с диаметром 22-28 нм во фракциях 1 — ill сферические частицы и волокна, но фракциях lV -Ql, гла.вным образом небольшие сферические ча стицы и некоторое количество волокон но фракциях Vll ч Vill

Концентрированные образцы из предыдущих стадий подвергали полной очистке плотностным градиентным цент- Щ рифугиронанием.

Очищенные препараты HBsAg, состоящие главным образом из сферических частиц диаметром 20-22 нм, сферических частиц диаметром 22-28 нм, волокон различного размера и частиц

Дана, содержащих по 100 мг протеина, анализируют на полипептидный состав полиакриламид гелевым электрофорезом.

Количественную разницу наблюдают н протеиновых пиках индивидуальных образцов.

° Пики карбогидратов низкого молекулярного веса представляют собой гликолипиды, поскольку они не проявляются при голубом окрашивании по

Coomassie.

Вакцину готовят иэ фракций крупных частиц, полученных в результате добавления человеческого сывороточного альбумина с концентрацией

0,5 мг/мл с последующей инактинацией по сериям облучением от кобальтового источника (2,5 миллиона рад) инактивацией формалином с использованием общепринятых методик (37 С, 96 ч, концентрация 1:2,000), с последующим использованием Р-пропиолактона по методикам, обычно используемым при производстве вакцин против бешенства.

Пример 2. Модифицированная .усонершенствованная PEG методика для выделения HBsAg/е.

Модифицированную методику для осаждения PEG используют на 2,6 л смешанной НВэА9, содержащей плазмы от одного шимпанзе-носителя, содержащего е-антиген н необъединенном, неосажденном виде. рН плазмы устанавливают равным приблизительно 4,6 и немедленно добавляют 30%-ный раствор PEG до конечной концентрации 2%.

Раствор вымораживают на льду н течение 30 мин (вместо стояния в течение ночи при 4 С, как в предыдущем примере) и осадок удаляют центриФугированием.

Во всплывшем слое, содержащем

HBsAg, устанавливают концентрацйю

PEG, равную 4% (нместо 4,5% н предыдущем примере) в результате добавления б,б ч на 100 30%-ного раствора

PEG при комнатной температуре. Суспензию снова вымораживают на льду в течение 30 мин и осажденный

HBsAg/е удаляют центрифугиронанием.

Осадок ресуспендируют до 200 мл в дистиллированной воде. Основную часть

PEG и сопутствующих примес и ) д ляю

< ? 87?О

10 путем установления рН, равным 5, 0, вымаааживанием раствора на льду в течение 30 мин и удалением полученного в результате осадка центрифугираванием. рН прозрачного всплывшего слоя иэ предыдущей стадии вновь устанавливают равным 4,6 и добавляют 30%

PEG да конечной концентрации порядка 3% (вместо 4,.0-4,5%, как зта целали pa«ee). Вещество вновь вымаракивают на льду в течение 30 мин и асацак HB sAg /e aësr

Осадок из предыдущей стадии, содержащий НВзАу/е, суспендируют в

10 мл дистиллированной воды. Оcíoâ. ную массу PFG осаждают в результате установле rrra рН равным 5,0. После

О стояния в течение ночи при 4 С суспензию осветляют центрифугированием.

Прозрачный верхний слой, содержащий

HBsAg/e, дополняют 0,5 N натрий-фосФатным буферам при рН 7,2 да конечной концентрации порядка 0,03 И и устанавливают конечный объем, равный

120 мл с помощью дистиллированной воды.

Результаты такой очистки показывают более чем 33-кратную очистку HBsAg

Пример 3. бракциониравание

НВзА<)/е периодической обработкой гидроксилапатитам.

Ресуспендираванный PEG осадок

HBsAg/е (пример 2) обрабатывают периодически гидраксилапатитом вместо процесса хроматаграфирования на колонке, .500 мл объем насадачнаго гидроксилапатита (Bio-Rad-Labs) суспендиру т в 800 мл 0,02 М натрий-фосфатнам буфере при рН 7,2 и после добавления препарата. HBsAg/е перемешивают магнитной мешалкой в течение

30 мин при комнатной температуре.

Шлам делят на две равные аликвоты и центрифугируют в чашах емкостью

1 л на центрифуге SorvaII RC-3 со скоростью 4,000 аб/мин в течение

10 мин. Верхний слой декантируют и осадок последовательно промывают порциями в 1 л с 0,02 N и 0,05% .на трий-фасфатнага буфера при рН 7,2, Элюаты объединяют, концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембраны PN-30 и диафильтруют 0,02 N

Фосфатным буфером с рН 7,.?, 0,02%

НаН3 и доводят да объема 60 мл тем же буфером.

Концентрированный образец далее очищают скоростным зональным центрифугираванием в прерывном градиенте сахаразы.

Отделенные частицы HBsAg/е разделяют на три фракции, диализируют и концентрируют ультрафильтрацией.

Образцы,. исследованные методам электрон",oé микроскопии, обнаружили главным образом крупные волокна и частицы Дана во фракции 1; волокна, частицы Дана и сферические частицы д1ламетром 22 -28 нм во фракции и и сферические частицы д)ламетрам 20-28 нм во фракции tl.

Пример 4;:Дисаггрегация

HBsAg/å частиц с помощью ионных и неионных детергентав.

HBsAg /e частицы обрабатывают при комнатной температуре (в течение

5 мин — 2 ч) следующими детергентал: 0,5-2% ibohidett NP (детергент) (SheII 0iI Са.), 0,5-2% Твина 80 (поверхностна-активный агент), 5-10%

Тритона Х-100 (органический поверхнаст ro-aктиэный агент), 0,1-1,0% дадецилсульбата натрия и т.д. Целью обработки является усиление антигеннай активности в образцах, обработанных детергентом, и инактивация инфекциазности этих образцов.

Оптимальные условия обработки определяют путем анализа образцов перед и после обработки детергентом с использованием тонкослайной и изоэлектрической фокусировки. Индивидуальные компоненты дисаггрегированных образцов могут быть выделены с использованием различных методик разделения, например молекулярным исключением, адсорбцией, способами ионообменного хроматографическога ультрацентрифугирования, различными методами электрофореза и т.д.

Одним из наиболее высокоэффективных способов является метод занного конBer

Иэоэлектрическое фокусирование, Тонкие слои получают на Sephadex75 гель целлюлазнога носителя в 1%нам растворе амфолина при рН 4,0-6,0 или рН 3,5 — 10,0. Пластины помещают в льтипоравое устройство. Отпечат<и делают на хроматографической .бумаге. Отпечатки разделяют вдоль линии отделенных образцов и разрезают

:-:а зоны 0,5 — 1 см. Индивидуальные завы далее разрезают на более мелкие части, с :ачивают 0,2 мл буферного салевага раствора и элюируют 0,2 мл нормальной (не содержащей HBsAg u анти-НВ) человеческой сыворотки. ,"1ли1<ваты в 200 мл из каждого элюата используют для радиоиммуноанализа.

Полоски между разделенными обраэцамн также разрезают, элюируют 0,4 мл дегазираваннай дистиллированной воды н используют для измерения рН. Если берут дгa отпечатка, то первый используют для окрашивания на протеин а второй разрезают для радиоиммунаанализа на HBsAg и измерений рН. йликвоту из каждого образца обрабатывают 5-10% неианного детергента i r2pèòîí Х-100) в течение 20 мин при комнатной температуре перед кантактиравалиeм с гелем и выдерживают при описанных выше условиях при сравнении с образцом, который еще не обрабатывали детергентами.

;: .-;.,/ -.

Е КОЛО: —:Н<ЭЙ ХРО(т(дг! Оi irrs il .1 )>,ст, КГ!;! i аП2 ТИТЕ т анаЛИ 3((: : "! т,, (3 (>1 ной изоэле:<тричесi<ОЙ <(>с), Препараf состоящий i >д 3;,-. - Об, Яз сферичес)ких частс(с(:ц)(д.: е !.po;:. 2

2 8 нм и Гете(эот ен ной с:1<)ес.>, с;> (:<.сэр.

:кс>с(4ей B QciloBHQ(v боле —...(рт n (ь>Г ..а!) ТОНО Ут Т 0). IJOC !1 ЕЛ! ЬНО i iò! 3,, т . . <."i;= rir- ..

Е 3 Еро ГЕН k(QC си В П>ОБЕ,Э 1(1!ОСТ -,Qi)т "„;,i) я

Дс чаГтиЦ ., ОснО Вной 17!! (;-<(- т -.! J е;,HQ(! аl(т.:Вност-; был Gбнаружен J!ри РН 4 8

И дда НЕ3На .ИтЕЛЬНЬЬХ Iòh) B с К (ИВ(!ОС; ,".и наблюдали при рЫ " О--,. 1 и рН

4 /:;т -4 „. 6 . Обрсзцы (7ocf(e 0()ps I)QT)(kr

3(L 0 0 H0(Е -! HB аи Ти ГЕН,-1 ой;-„(:13; Bki0 01 8 !",с)УГих э кспе(эим<=нтс(i(Hаб3!(ОДдли

ПО ВЬБттЕНИЕ с!(<ТИ ВНОСТИ В 2 .-8 }Эс 3 .. vpo ме некоторой(:"статоч((ОЙ анти генной активности, наблюдаемой в первона" -а !.т Ь (j Q ki 0 б Л сl С Т И Н И 3 К И Х 3 Н а и Е Н И И рН рН 4, 1-5, 0 j „основнь(е п ir

5, 3,цо 5,9 и незначительный пик i(p?H

»I- // — 7 т 2., =---Антигенная актиьност(-, 0 а ООН аP>v/>KЕН а ЛИШЬ В Ин ТeРвдЛЕ рН, I) 4 . = >. QT антиГен был Об(= (Цэч

3 ТОЙ О Лс> (т(Нст Ir/ BC TB Èòý>I>Ь 1; -,rvi !

10!)Ь)Tа-(Иe)V(.I:;ИффУ3ИИ На Х CЛe 2ГСPта (соне нный Вс(кЦиОннь) прОЦ>т кT T(QJ)r/ "

:.B1) I по методике примера 1 с и споль"Овд НИ ЕМ ЧЕЛС ВЕЧЕ Скос 0 аЛЬОУМИН д. и метоцик инактивации с желаемой ара(< !!ией пОс>!е детерГентнОЙ ассОцидцеи *

П р -! !v(е р 5 . Очистка. pcicTBQp(! мото с--антиге!.а из плазмы хрони (ес-" ((их носителей IIBsAg/е для .-..тcsofii 30-,:а:-(ия В кдт!естве Вакцины

jIBsAg /e пол<)жительн аF. с iл с зма со !

>эр)>()<т v3 — BH H (JH Bl ра(".1 ВО)11>пт<С)/11 (-! ()Е с1ССОЦИИ ЭО Вд Нl НОЙ С -(BOTH!!(Bй . ИЛ) i (т!Х . 1 0 0 0 0 0 C ) <, )оp(viE т акая <)>о !э(с!а превалирует во многих плазмах та)<ого типа и поэтому может Jipsjl(та для

1 О бой! НДеал ьнь(Й исто!<и т-,к 13 а>) 1 H гrsi для яммуниза!(ии.

Свойства растворимо "о е-антиг.",;:: =. бы/!н определены как следующие: плотнссть CsCI/Õ>28 — 1,29; S2(3„/= .1>1!6, молекулярный Brsc 150000-900000; изоэлектрическая точка 5,5-6,, б, элю);роВдние из диэтиламиноэти/л целлюл<озы при О „15 М ЫаС1.

На Основании BTI?x. свойств бьв: работан следующий сг(особ очистки, EIBsAg/å плазму вна-ыле частично осаждают PEG 6000 с удалением НВВ 1(з ассоциированных частиц и некоторы<) протеинов сыворотки в результате

Осаждения 5 9%/ предпОчтительно 8 - -.

Вес//обсьем/ РЕ6 ОООО при рН 7 > О „20 О. с последующим осаждением е-антиген=-. н некоторых протеинов плазмы с по:.!Qщью РЕ(при 9-13% PEG концентрации.

ЦНИИ(!И Заказ 3171/54 .Гт!

43)mHBл 1II1II EIBте>-1 T, г, 1 дд тт. i. — с k i. / .!isii, !"!P J В,! 1;т

; >тп (ро! а, "О 30 Лв с 1 I 11 С 6!"-т -rrc И)1/ =. ° . (> (! 1 —.. (vo i ф О К ; . i 1:, l i, К Е: 0 .

1)0, Г(Э>(д >,.=.(, 2 :. =.:.

)Н 3 10 (с ; . 1 ":,= 1<тт! (. >1" 0

05 (7 <(> .(<1)b. ст(,3."; c <1>,! . О; 0 11! .,.и

Е Р -. 3 К 0 —, (- <;,,- t I и . I, i —.; 1 !(-,1- J(o 3 О 1)т, 1 /()авl(01>;= >(С .11((с r 1 1 ГМ;: б, <(popo. .i, З.:ЮИ" рова<г-I»= 0<-. ><Эстд)1()!От (л>1 ней( радliе! 10!т! О, (0 i ) ."! <>а01 В 10(т! 3(е

fj 1фе1)е ., i-— - ./:g -! >(, 1)> j>, JB 1 при 0 1 э !с

I4BCÕ с BHkj <-.-i e -епыо чис =: ы.

Ij(iCi(ic. Кoi) (1 еН;-тди!)О!> д И(И! я > - =-:;13И:l р2>Ц>(ЕИ О(- I)BÞ! J 0 ":h Qll. (13 CH .ц .!)1 (Ci

С>:<ОРС:Ст((: —.: "-О д! Ьньты:тЕ- т ЭИ<)3, Г.:Р<-Ваннем л 3 0 -30 ь- г1эа/-.>,Иенте сахгрозь!

)(ЛИ Э -(BH В сIЛОТ ИОСТ НОМ I pc. д(унтe сс рpе(е !cpa!)!(el(1 1,6 пика

0 .lи(ценнь. и д:- -т9 c"1 д били зируlОт дс— бс(влением длхсб>/ J(isci. челОВеческой сыворотки до концеи Г-)эации поря цка

0 . Э lv .is/iv!3 i, Такие препараты при кос!Цен трации

ОКОЛО 20 iv(1(B !(B дозу (0(>/T бЫТЬ пользова«ы В качес(ве вакцинь. против гспатита Б после инак(ивдции >(стеРИ)(И 3 ".1 il И::,, J. I p i3 (1 3 l ñl Г 2 Е с ! С ! С С 0 б Г Q 3 B (. Л S - S i i (3 =

ВЫСИТ Ь Ci(С (i, 1ôè ×IIÎÑÒ с. Попу>(ан(!ОЙ >дд К

>i-ij-, r.—!,Нl! Я (j7QCQ 17 Г!ОЛ" -(Г if) BB)1ЦНН! * Jjr)0

Тив !. Bj(B7 И д. О ll „- ". --l,i ВЫцт ЛЕНИН Час ! Ь((т I I ББ><(9т,:. <)Д<33(Э>)(сат! Ib>3(Е дl; ТИ ГЕН HB крови )Оителе--; а: †.7:.Гена Гепати(= . R, < С j >((дЩЕ ст сд - - () т И- — си С; Ti QC1(c 1-i1",(rт-,Е и

)(ll ак "И Вс(1>,ИЕЙ <с)7(БОГ 0 „(РОДУ)< I(B > Q . ..О((> 1(31>:I .-с! .. ... I:.-- . : i 11)oc7 .) тт с!*с! 1>1: i. II i3! с1 3Jv!1, }

5 BCÃ, с ПС)ли . Т -(ЛЕ;1 Г>!!! КОЛЯ ПГЭИ 1)Н

/ (-,ОЛ!.с<,- Н((13)! ОоаДО;<, СОДЕ)Эжа= щий IIEjSAQ r!2!C 1 Jib) 02!3<-.тет.".)м 30 — .. О ИМ. .„эаствор>яют (то((рl1 4 . 9 -5 ., За! д(/т рН нацосадс,но-... -; жид)(о«" s r(osопят до

ПО Об l:!-0 (<,. -, Л>

И ". - с cr!, -,т.ТС; J r!3 Л- Вс>й Hpo„ ),у! T

;)ь ri (<т.;1зиру>(О .. Г бра бОJ HQ. i (()Ормс Ji;;IH Qi i .: !! 8! («10П)(ОЛB J- . T, HQ(r(":4Л . Г блу -: д. ПЕ" 1 . О Ь> (Э т(И (iтт )Тт> - — > <7 .

"1 С т С -! и Н К Н:: с фо !. т () 1 т! ((. .-ЭЕ BO !)НИМдl111!с ПР:i Э ((Cl!rsj> i rë 3(-Н; - =„.-(7 C"((Ä = -6 (с-19 1

<3>1, 424-8 9 1,