731904 - Способ идентификации микроорганизмов

Способ идентификации микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

вжжюзнМ итйНТ06-техничес ..="; ." бл тем МЕ"

ОП Н-И Е, I73I904

Сакгз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К П А ТЕНТУ (61) Дополнительный к патентувЂ” (22) Заявлено 31.03.77 (21) 2466678 28-13 (23) Приоритет вЂ” (32) 31.03.76 (51) Ч.Кл.2 С 12 К 1/04

Гасударственный комитет

СССР (31) 672292 (33) CIIIA по делам изобретений и открытий

i 53) УЛК 576.8.093.1 (088.8) (43) Опубликовано 30.04.80. Бюллетень № 16 (45) Дата опубликования описания 30.05.80 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Стефан Аллен Морс и Барбара Хотан Иглевски (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к области диагностической микробиологии, а именно к идентификации бактерий, Известен способ определения наличия микроорганизмов в биологическом материале путем посева на питательную среду с последующим контактированием выросших колоний с бактериоцином, инкубированием и учетом наличия или отсутствия роста (1).

Однако известный способ является трудоемким, так как необходимо наличие специфического бактериоцина.

Целью изобретения является упрощение способа.

Эта цель достигается тем, что вырос шие колонии контактируют с бактериоцином R-типа из микроорганизмов таксономически несвязанного рода.

Кроме того, в качестве бактериоцина используют пиоцин Pseudomonas aerugiпоза АТСС 29260, типированный как 611131.

При этом идентифицируют микроорганизм Neisseria допогrhoeae.

Для определения наличия микроорганизмов используют в качестве бактериоциFIa пиоцин R-типа (611131), полученный нз штамма Pseudomonas aeruginosa АТСС

29260.

Основная среда содержит в 1 л следующие компоненты, г: протеоза-пептон № 3 (Дифко) 15; 14НРО4 4; КН Р04 1; NaC15 и растворимый крахмал 1, рН среды составляет 7,2. Если среду используют для получения ппоцинов R-типа с помощью

P. aeruginosa, то после автоклавирования добавляют глицерин 1 об. % и мононатриевую соль глутаминовой кислоты вЂ” 8,46 г/л

Если среду используют для роста Neisseria

sp., то после автоклавпровання добавляют ростовой фактор 1 об. /о, идентичный по составу с обогатнтелем типа Iso Vitalex, и добавляют глюкозу вЂ” 5 г/л, ХаНСОзвЂ”

42 мг/ г.

Выращивают и очищают пноцнн R-типа

I5 (611131) следующим образом.

Заготовленную с вечера культуру Pseudomonas aeruginosa АТСС 29260 центрифугируют и повторно суспензируют до /1„ первоначального объема в растворе, содержа шсзг 0.8 /- ХаС1 ц 0,1 О цистпн хлоргидРат пРи РН 6,5. 1 об. а/о посевной кУльтуры используют для выращивания на качалке прп 37" С.

Когда мутность культуры достигнет примерно 150 ед. Клетта, добавляют митомпцпн С при конечной концентрации

1 лкг/пьг. Выращивание продолжают до тех пор, пока не произойдет лизис культуpIu причем это происходит по истечении трех часов после добавления мптомицина С, 731904 е

Таблица 1

Титр ингибируюгцего действие, ед/еал

Организм не инду цированный индуцированный

Р. aeruginosa Ррг

55 N. gonorrhoea. )"

N. gonorrhoeoe

DG1 1947

N. допоггЛоеае !

138 (Т-1)

N. допоггЛоеае

6Р !138 (T-4) 2560

25610

40,960

40i,960

640

10,240

N . D3

М D

5е120

5,120 туру,: дуцированную митомицином С, uсптрпфугируют с 2400 кратным ускорением в течение 30 мин для удаления клеточных остатков и пол)учаюгцийся в результате отстаивания верхний слой обрабатывают хлороформом (5 об. /o). Эта всплывшая наверх фракция и есть сырой пиоцин.

Сырой пиоцин далее очищают путем

:io.Ioàaления IМ МпСЬ (60 мл на 1 л лизата), примешивая при этом смесь к сырому пиоцину. После достижения рН 7,5 с по.мощью I M NaOH полученный осадок удаляют ценврифугированием. Всплывшая

FIаверх фаза является очищенным пиоцином.

Дальнейшую очистку проводят добавлением (NH<) qSO4 до 70 /о-ного насыщения и культивированием в течение ночи при

4 С.

После центр ифугиров ания в течение

30 чин при 4 С осадок от центрифугнрования, содержащий компонент с пиоциновой активностью, растворяют в 50 мл

0,01М rpuc- (оксиметил) -аминометан-(трис)iëoðrèäðàòà рН 7,5, содержащем 0,01М

4gCI, и 0,01М /!gSO<, и подвергают диализу в течение почи при 4 С против 2 л того же буфера. При необходимости препарат осветляют центрифугированием в течение 90 мин.,еКелатиноподобный осадок от центрифугирования осторожно растворяют в 20 ил буфера и хроматографируют на целлюлозе ДЕАЕ, предварительно nipoмытой аи доведенной до равновесного состояния с помощью того же буфера В колонку размером 1,5><28 с и вносят 8 мл образца пиоцина и адсорбируют в течение

1 ч. Колонку промывают 200 мл буфера лля удаления веществ, неадсорбированных на целлюлозе типа ДЕАЕ. Затем пиоцин элюируют с помощью 800 мм в 0,01М буфере. Собирают фракции по б мл !и анали-"èðóþò на поглощение при 280 нм и на теоциновую активность.

Фракции, проявляющие пиоциновую активность, диал!изируют против 0,01М трисбуфера, рН 7,5 для удаления NaCI, а затем концентрируют с помощью ультрацентрифугирования в течение 90 мин.

Типизацию пиоцина осуществляют, используя метод жидкой среды, описанный

Джоном.

Штаммы Neisseria gonorrhoeae, которые испытывают на восприимчивость к пиоцину, выращивают в течение ночи в чашках с агаровой средой. Суспенз!ию этих микроорганизмов приготавливают в разбавителе, состоящем,из 0,85/о NaCI и 0,1% HCI (рН

6,4), и доводят до IIQIKaaaHIHH Клетта, paiBHblx

50 вЂ” 60. Чашки с агаровой средой заражают с помощью тампона, погруженного в клеточную суспензию. Неразбавленные или серийно разбавленные препараты пиоцина (5 мкл) вносят на поверхность чашек с агаровой средой. Все чашки культивируют в течение ночи при 37 С с повышенным содержанием СО .

Пиоцины были приготовлены для изучения под электронным микроскопом с помощью метода негативного пятнистого окраш!ивания. Препараты пиоцина центрифугируют с ускорением в 100000 q в течение

1 ч, и осадок от центрифугирования повторно суспендируют в малом объеме

IN NH4C H,O> (pH 7Я). Медные сеточки, покрытые формваром, вносят в каплю образца в течение 1 вЂ” 2 мин, а затем промокают досуха с помощью фильтровальной бумаги. Эти сеточки вносят затем в кап15 о/ лю 1,5 /о -ного ра створа фосфовольфрамата натрия (pH 7,0) в течение 30 с. Избыток жидкости уда.пяют фильтровальной бумагой.

Взаимодействие пиоцинов с,клетками

20 Neisseria допогйоеае обнаруживают по подобной методике. Спустя 30 мин после добавления пиоцина к жидкой !культуре

N. gonorrhoeae 72Н870, образец удаляют и обрабатывают так же, как это было опи25 сано. Препарат с негативно окрашенными пятнами был изучен с помощью электронного микроскопа RCA (при 50 кВ) В табл, 1 даны результаты производ30 ства гонококкового фактора .инпибирования, синтезированного во время выращивания

Pseudomonas aeruginosa АТСС 29260 в указанной среде. Добавление митомицина С (1 мкгlмл) вызывает широкий лизис куль35 туры в пределах 3 и и приводит к 16-кратному увеличению концентрации фактора инпибирования, определенного путем титрования на Pseudomonas aeruginosa Pp7 и

1947. В таблице также показан титр фак4о шта!ммах N. gonorrhoeae типа ЛЪ -31 и DGI тора ингибирования, изменяющийся с изменением различных штаммов Neisseria

gonorrhoeae, причем не наблюдается различий с колониальными вариантами еди45 ничного штамма.

Примеч гни : а) Митомицин С (1 мкг на

1 лл среды) при последовательном разбавлении не был способен ингибировать рост указанных организмов при разбавлении l:2 (О,б,икг/мл);

65 б) N,D вЂ” не огределнлось

731904

Taoл,IBa 2

А 4

В 5

С 3

X 3

Y 1

5С

О о

О о о

1! 1

135

Х..г:!ага.са о.- а с

Фактор ингибирования был частично очищен от всплывающих навср.- жидких фаз культур Pseudomonas ееruginosa штамма АТСС 29260, индуцированных митомицином С, по методике, описанной выше. Фактор ингибирования элюируют из целлюлозы ДЕЛЕ с помощью NaC1 градиента от 0 до 1,0М. Обнаруживают два пика, содержащие фактор ингибирования.

Главный пик (a) элюируется при концентрации NaCI 0,06М .и обладает более, чем

90% -ной ингибиторной активностью. Слабый пик (б) элюируется при концентрации

NaCI 0,91М и обладает менее, чем 10%-ной активностью. Фракции, составляющие пик а, объелиняют, диализир уют против 0,01 трисхлоргидратного буфера (pH 7,5) для удаления NaC1 и концентрируют ультрацентр ифугированием (100 ООО-кратное ускорение в течение 90 мин). Этот препарат используют в описываемых ниже испытаниях.

Изучение с помощью электронного микроскопа препарата с негативно окрашенными пятнами из очищенного фактора ингибирования показывает, что частицы напоминают пиоцины R-типа как в несокращенном, так и в сокращенном состояниях. В несокращенном состоянии эти частицы имеют длину ll 5 нм и ширину 15,3 нм. В сокращенном состоянии частицы состоят из внутреннего ядра (длиной 105 нм и шириной

6,5 нм), окруженного сокращенной оболочкой (длиной 44,4 нм и шириной 18,6 нм) .

В сокращенном состоянии находилось 20вЂ”

30% частиц, наблюдаемых в этих препаратах.

Тип пиоцина как в час-,ично очищениз рассеянных, так и нерассеянных заражений ингибируются. Однако ингибируются только 3 из 20 штаммов N. meningitidis u

5 из 16 штаммов Х. )actamica. Не наблюдается какой-либо корреляции между серологической группой и ингибированием цых, так и в очищенных препаратах определяют по вышеописанной методике, причем результаты показывают, что модель :е изменяется з.-. время очистки. Пиоцин относится к модели 611131.

Действие пиоцина 611131 на рост клинического изолята Neisseria gonorrhoeae (штамм 72Н870).

Действие аиоцина на рост клеток ми к роорганизма было определено добавлением различных концентраций очищенного препарата к экспоненциально растущим культурамм.

При высоких концентрациях пиоцина полное ингибирование роста, происходящее в пределах 1 ч, сопровождается широким лизисом культуры. Изучение с помощью электронного микроскопа показывает, что между пиоцином и чувствительными клетками Jeisseria gonorrhoeae происходит непосредственное взаимодействие. Взаимодействие пноцина с клетками приводит к сокращению пиоцина.

Спектр ингибирования пиоцина типа

61113!.

Лликвотные части очищенного препарата пиоцина наносят в виде пятен на посевы, полученные из клинических изолятов

N. gonorrhoeae. Зона ингибированяя отчетливо видна во всех изученных штаммах.

Не наблюдается различий между колониями типа Т-1 и Т-4 из одного и того же штамма. Включен также отрицательный контрольный тест продуцирующего штамма

P. aeruginosa ЛТСС 29260.

Инпибирование различных зилов Neisseria с помощью этого пиоцина показано э табл. 2. Все изоляты N. gonorrhoeae как

Число Число

Серо- испыты-, чувствигруппа, вавшихся . телвиыа штачгаов штамиов

1U. meningitidis. Ни олин из других пяти

40 испытанных видов не::н.-ибируется этим пиоцином.

Быстрая идентификация Ne! sseria gonorrhoeae.

731904 ста на той части чашки, в которую был внесен пиоцин.

Этот метод может быть применен для ндентиф икации других бактерий.

Таблица 3

Бактериоции

PS. aerugiпоза

FS-5

PS. aerugiпоза

FS-6

PS. aerugi- PS. aerugi поза АТСС поза

29260 PS-7

Организм

Neisseria gonorrhoeae

ЛФ-31

N. gonorrhoeae

N, gonorrhoeae

72Н 874

72H873

1938, 1567

1344

2024

1817

1947

1402

1918

1451

По этому методу пиоцины, производимые и очищенные так, как это описано вы ше, размечают флюоресцеином согласно метод у Джонсона. Меченые таким образом пиоцины реагируют о подозреваемой N. gonorrhoeae на предметном стекле, приготовленном,из клинического материала или из изолированных колоний из чашки с агаровой средой. Избыток пиоцинов удаляют промывкой предметного стекла 0,02 молярным физ иологическим (рН 7,2) буфером, буферированным фосфатом, и предметное стекло рассматривают под уф-микроскопом. 40

Клетки, имеющие типичную морфологию

N. gonorrhoeae и показывающие флюоресценцию, рассматриваются как положительные для N. gonorrhoeae.

Метод для быстрой идентиф икации

Neisseria gonorrhoeae может быть осуществлен по любой из следующих методик: пиоцин 611131 наносят в виде пятна в чашку с агаровой средой, содержащую биологический образец, который испытывается, или диск, пропитанный пиоцином, вносится в чашку, зараженную образцом, ил и же пиоцин, внесенный в одну половину чашки с расщепленной агаровой средой, заражается образцом. Вслед за культивированием осуществляют идентификацию микроорганизма в виде N. gonorrhoeae на основе зоны инпибирования, окружающей пятно, куда нанесен пиоцин, или ингибирования рометод тип|изации особенно полезен при эпидемиологических исследованиях, когда важно преобладание или появление новых штаммов, а также при определении обусловлена ли неудача обработии устойчивостью микроорганизма или повторным заражением новым типом микроорганизма.

Дополнительные варианты изобретения описаны ниже.

Идентификация N. gonorrhoeae, используя пиоцины, меченые флюоресцеином.

Типизация Neisseria gonorrhoeae.

Типизация Ni. gonorrhoeae и других ви дов Neisseria включает использование нескольких типов пиоцина и основывается на ингибировании или неингибировании испытываемых микроорганизмов. Наблюдаемые результаты используются для идентификации типа изолята путем соотнесения их с результатами, полученными с помощью целого ряда известных типов (табл. 3) . Этот

Идентификация бактерий с помощью пиоцинов, меченых радиоактивным изотопом.

Радиоактивные пиоцины получают путем йодирования их изотопом " J с помощью метода с применением хлорамина Т. Их можно получить мечеными с Н или 4 С путем ввода конкретных меченых аминокислот в культивируемую среду до начала синтеза пиоцина в Pseudomonas aeruginosa с помощью митомицина С. Пиоцины, производимые по этому методу, являются радиоактивными. Специфические бактерии легко идентифицируются путем взаимодействия радиоактивных пиоцинов с суспензией бактерий. Затем эту суспензию подвергают мембранной фильтрации или центрифугироaànè!o для отделения несвязанных пиоцинов от пиоцинов, которые связаны специфически с поверхностью бактер иальных клеток, Фильтр или промытый клеточный осадок в пробирке после центрифугирования принимают затем во внимание, чтобы определить количество связанного пиоцина, который был меченым. Данные сравнивают со степенью неспецифического связывания, лю бое увеличение над уровнем неспецифического связывания показывает наличие неизвестного микроорганизма.

731904

10 (5, 6 7

Организм

J%-31

72Н 874

72Н873

1938

1567

1344

2024

1817

1947

1402

1918

1451 а>

166

60Е

+/вЂ”

478 Р

В838

4326

1601

+/вЂ”

I+/â€”

+ ( (1

10178

mut-CP (0123

1019(>

10570 (0573

10583

+ (:

1:, !

1 >69 !

0340 ( ( (< (Sal, kadack

Sal. miarembe

Sal. onderspoort

Sal. thompson

Sal. spp. Group С.

Serrat>a mercescens 13880

S. marcescens

Shigell a f I exneri

Sh. spp. Group D

Brucella abortus

В. bronchisepticus

В. suis

Neisseria gonorrhoeae

N. gonorrhoeae

N. meningitidis

N. meningitiйя

N. f lava

N. Пачезсе»з

N. lactam>a

N. lactamica

N. mucosa

N. ov>s

N. perf lava

N. subf(ava

Acin"tobacter anitratus

А. an>tratus

А. са!соасе((с<>в

Аегог»<>п, в hyd>ophil>a

Alcaligenes viscosity

Azotomanas >nsulita

Enterubacter acr<>g>enus

Е. cloaceae

Е. с1оасеае

Е. сlоасеае

Exheric(>ia co1i

E. c<>(i

Е, co(i

E. co(I

E. coli

Е col i

Е. culi В.

E с< 1(i<>d<>le СР

Е, c<>i> Se

Е. col(1. С 411

E. co(i К.

E. с<>1> К 12

E. cuii e«>(tie

Haffn> Si>p

lerre 1eà Vagin<>co(Н Vag(n с ia

Н. Чag(n< с,1

Н ч< <>o«» >

Hle<>s>ui(t> oа

К. рпец,!Io><>а

К. Pneun>oni(>e

К. pneu

Mima polymorpha

Proteus n>organic

Providencia s tuartie

Бактериоцин

1 2 3

Таблица 4

731904

Продолжение табл. 4

Ба ктериоции

Орта иизи

2 5 вЂ” +

+/ вЂ” j +

+/вЂ”

+ ! ! 1 +/ вЂ” ( +/вЂ”

1 ( вЂ” +

j +/вЂ”

aeruginosa FS вЂ” 5

aeruginosa FS вЂ” 6

aeruginosa РА 108

aeruginosa PS вЂ” 7

Vibrtocholera Еа Toz

Serratia тпагсеасеиа

ornonas Ьуdrophilia

Bacteriocin

Bactertocin

Bacteriocin =acteriocin зacieriocin

3acterioctn л а c t eт1oc1п

1:Ps

2:Ps

3:Ps

4:Ps

5:Ps

6:Ps

7: tcr

П р и м е ч а в и е.

Рс;е dontori е;ug!nos:-

Р-

PS. аегир и аа иои р;1."т.

Р, а1ка!tvr ис s

Р .;и 10!o. ..cr rts

PS. ma! tophtba

Р8.:r.ài оo!! Iiа I

su celt aropIt dju

SzI . onå11, ariz .и1.е

Sal. bergen

Sal. bornum а1. cholerasuis

Sa1. dahlern . al. deversoir

8 а l. d ja ka r ta

Sal. dugbe

Sa 1. enteriditis

Sa1. florida

Изобретение может быть использовано при идентификации антигенов, которые являются свойственными для бактерий таксокомически несвязанных родов. Как извест но, бактериоцины связываются с специфическими рецепторными участками на внешней поверхности бактерий. Эти рецепторные участки подвергаются также действию механизмов защиты хозяина и могут таким образом стимулировать производство антител, которые могут быть либо бактерицидного, либо опсонизирующего типов. Бактерии могут делить свойственные антигены.

Эти свойственные антигены могут быть также бактериоциновыми рецепторными участками, поэтому взаимодействие бактериоцинов с разными видами бактерий может быть использовано в качестве индикатора раздеIsIoiIIHxcH антигенов (табл. 4). Это, в свою очередь, может быть использовано при выделен ии и очистке антигенов для производства вакцин, Таким образом, второстепенный антиген на одном микроорганизме может быть главным антигеном на другом и поэтому может облегчать очистку и может быть получен в больших количествах.

Способ может быть использован также для демонстрирования свойственных анти генов (или поверхностных компонентов) в клетках млекопитающих, Вследствие свойственной специфичности их рецепторов бактериоцины могут быть использованы вместо соединений, таких как лектины, ;r.i! в методиках, включающих типизацию тка..;11.

Изобретение может быть использовано также при идентификации других бак-.e- d.l.

Таким образо1м, как это показано B та .л. 4, бактериоцины из Vibro cholerae, Аегогпаз

Hydrophila u Serratia marcescens обычно перекрестно реагируют с таксономически несвязанным микроорганизмом.

Предлагаемый способ позволяет упростить определение наличия микроорганизма с использованием любого бактериазича.

Формула изобретения

1. Способ идентификации микрооргaííaмов в биолопическом материале путем госева на питательную среду с последу1сщим

2о контактированием выросших колоний с бактериоцином, инкубированием и учетом наличия или отсутствия роста, о т л и . а к:шийся тем, что, с целью упрощения способа, выросшие колонии контактируют с бактериоцином R-типа из микроорганиз .св та ксономическ1и несвязанного рода.

2, Способ по п. 1, отличающпйс-тем. что в качестве бактериоцина испсльзуют пиоцин Pseudomortas aerugirtosa АТСС

29260, тппир ванный как 611131.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что идентифицируют микроорганизм

Хе1sserià gonorrhoeae.

7319О4

Состав rre:ь С. Малютина

Техрсд А. Камышниковг

Корректор С. Файн

Редактор T. Пилипенко

Заказ 580/706 Изд. М 310 Тпргкк 522 Г1одпнсно

НПО «Поиск> Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1!3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Тип, Хгрьк. фпл. пред. «Патент»

Источник информации, принятый во ннимание при экспертизе:

i. ".т, Ъolk and S. Kraus «Asymptomatic

rneningococcal urethritis. Possible protective

i alue against gonococcal infec- .1în by b -cteriocin production», «British J. of venего1ogical Diseases», 1973, 49, р. 511 вЂ” 512.

Способ идентификации микроорганизмов

Патент 731904