Патент 732380

Способ фракционирования нуклеиновых кислот бактерий

 

Союз Советскнк

C оцналнстнческня

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и11 732380 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 180475 (21) 2125187/28-3 3 (51)м. кл.

С 12 D 13/06 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР по делам иэобретеннй. и открытий

Опубликовано 050580. Бюллетень ¹ 17 (53) УДК 668.З94 (088.8) Дата опубликования описания 080580 (72) Авторы изобретения

А. И. Коротяев и Т. П. Кроличенко

Кубанский медицинский институт имени Красной Армии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к биохимии, точнее к способу фракционирования нуклеиновых кислот бактерий для более полного и точного учитывания количест- венного содержания дезоксирибонуклеиновой (ДНК) и рибонуклеиновой (РНК) кислот бактерий.

Известен способ фракционирования нуклеиновых кислот бактерий, предусматривающий удаление свободных нуклеотидов и липидов из клеток бактерий щелочной гидролиз клеток и клеточйой РНК, осаждение ДНК и белкОв иэ гидролиэата, отделение надосадочной жидкости, содержащей рибонуклеотиды от осадка (1) .

Однако этот способ — классический метод, Шмидта-Тайнхаузера не может, обеспечить полного и надежного разделения ДНК и РНК, и, следовательно не может быть использован для определени я содержани я ДНК у бактерий, так как он приводит к резкому занижению ее содержания, в то время как результаты определения количества

PHK эавьпаены.

Целью изобретения является более полное и точное разделение нуклеиновых кислот на фракции.

Поставленная цель достигается тем, что надосадочную жидкость делят на две равные части, одну иэ которых обрабатывают этанолом для осаждения к ДНК, и осадок гидролизуют кислотой, после чего проводят количественное определение в полученных гидр эли з ат ах суммарной клет очной ДНК, а другую часть надосадочн ой жидко сти гидроли з уют и в полученном гидролизате определяют количественное содержание PHK.

Сущность способа заключается в следующем.

Определенную порцию фракции РНК нейтрализуют. концентрированным NaOH до рН 7,0, добавляют двойной объем холодного этанола (96 ) и выдерживаФТ 1 ч при -6 С ° Центрифугируют при

2-4оC в течение 1 ч при 8000 об/мин.

Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок, содержащий ДНК, подвергают кислотному гидролиэу. В полученном гидролиэате определяют количественное содержание ДНК. Общее содержание ДНК у бактерий определяется как сумма ДНК, полученнсй после щелочного гидролиэа, и ДНК, осажденной этанолом из фракции РНК.

732380

Для доказательства, что осаждаемый этанолом из фракции PHK осадок содержит действительно ДНК, используют три независимых метода: спектрофотометрический, колориметрический и метод обработки специфическими нуклеазами.

Спектрофотометрические исследования показали, что полученный осадок имеет характерный для нуклеиновых кислот УФ-спектр поглощения с мак O симумом при 260 нм.

Полученный осадок дает резко положительную реакцию с дифениламином, который специфически реагирует с дезоксирибозой.

Обработка осадка ДНК-азой приводит к резкому изменению седиментационных пиков, получаемых при аналитическом центрифугировании, в то время как обработка PHK-азой характера пиков на седиментограмме практичес- 20 ки не изменяет.

Специально проведенные исследования с использованием дифениламиновой реакции показывают, что количество ДНК, не поддающееся осаждению этанолом и остающееся во фракции РНК, не превышает 10-12%.

Пример . Культуру Е со61 М выращивают на мясо-:пептонном бульоне в течение 20 ч, 25 мл бульонной .культуры переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 2 С в течение 15 мин при 3000 об/мин для осаждения клеток. Надосадочную жидкость отбрасывают. Для удаления остатков питательной среды осадок клеток ресуспендируют в 15-20 мл, 0,15 М NaCI, центрифугируют при

2 С в течение 15 мин при 3000 об/мин.

Эту процедуру повторяют дважды, после чего удаляют кислотораствори- 40 мые нуклеотиды (строго при 2-4 С) .

Отмытые от питательной среды клет ки ресуспендируют в 10 мл холодной

3%-ной (НС1.04, суспензию выдержи вают 15 мин, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жид<ость сливают.

Процедуру повторяют до полного удаления кислоторастворимых нуклеоти.дов. Степень удаления нуклеотидов . контролируют путем спектрофотометрирования надосадочной жидкости при

260 нм. Отсутствие поглощения свидете 1ьствует о полном удалении кислоторастворимых нуклеотидов из клеток.

Затем осадок клеток после удаления кислоторастворимых нуклеотидов ресуспендируют. в: 15 мл этанола, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 25 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают . Процедуру повторяют Щ дважды (удаление липидов). Полученный осадок клеток, не содержащих кислоторастворимых нуклеотидов и липидов, рвсуспендируют в 4 мп 0,5 н.

ЧаОН. Гидролиз проводят при 37 С о в течение )8-20 ч (щелочной гидро лиз), отделяют щелочестабильную фракцию ДНК, для чего щелочной гидролизат клеток охлаждают 30 мин в ледяной бане, добавляют НС804 до конечной концентрации 6-73 (на 4 мп щелочного гидролизата 4 мл 15%-ной

НСРО4 ), выдерживают в ледяной бане

15 мин. В этих условиях согласно оригинальному методу ДНК выпадает в осадок. Осадок щелочностабильной фракции ДНК отделяют центрифугированием при 2 С в течение 30 мин при

60 00 об/мин °

Надосадочную жидкость, представляющую собой смесь PHK и щелочелабильной фракции ДНК, сливают в чистую пробирку и проводят количественное определение щелочностабильной ДНК.

Для этого осадок, содержащий щелочестабильную ДНК и неразрушенные щелочью белки, ресуспендируют в 4 мп

6Ъ-ной НС60 переносят в стеклянную пробирку, закрывают пробкой с каплеуловителем и 20 мин гидролизуют на кипящей водяной бане.

Затем кислотный гидролизат охлаждают, центрифугируют 20 мин при

3000 об/мин. Осадок отбрасывают, в надосадочной жидкости спектрофотометрически определяют содержание щелочестабильной ДНК путем измерения поглощения при 270 и 290 нм. Е27

0,160р Е29о 0,105.

Количество ДНК в пробе рассчитывают по формуле A.Ñ. Спирина (1958) (Ez o гяоМо,1 р

ДНК 019 где Сд к — количество ДНК в пробе,мкг;

Š— экстинкция раствора фрак270 ции при 270 нм;

Е д- экстинкция раствора фракции при 290 нм)

10,1- пересчетный коэффициент для ДНК;

0,19- разность между удельными экстинкциями при 270 и

290 нму

P — степень разведения. фракции. (0>1ЬО-O,105) 10,1 4

СА = „ =11,69мкг

Затем проводят отделение щелочелабильной фракции ДНК., Надосадочную жидкость после отделения осадка щелочестабильной ДНК (8 мп),. представляющую собой смесь

PHK и щелочелабильной фракции. ДНК, делят на две равные части. Одну часть (4 мл) используют для количественного определения PHK„Другую часть (4 мл) нейтрализуют ИаОН до рН 7,0 по лакмусу, добавляют двойной. объем холодного этанола {96, 8 мп) и выдерживают 1 ч при -6 С.

При этом фрагменты щелочелабильной

732380 х 2

0i 19 рнк

3S

50 где С нк

Е 27О

29о

10,5

0,19

55 бО

ДНК выпадают в осадок. Осадок отделяют надосадочной жидкости центрифугирсванием при 2ОC в течение 1 ч при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают и проводят, количественное определение щелочелабильной ДНК.

Полученный осадок ресуспендируют в 4 мл 6%-ной НС 04, переносят в стеклянную пробирку, закрывают пробкой с каплеуловителем, гидролизуют на кипящей водяной бане 20 мин.

Охлеждают, центрифугируют. Надосадочную жидкост ь спектрофотометрируют при 270 и 290 нм. Е О, 355;

Е29п О, 5225.

По формуле A.Ñ. Спирина определяют содержание щелочелабильной ДНК в пробе. (0 355- О, 2 2 5 (Ог (4"2=5 5,28 мкг

HocKGJIbKjj для определейия щелочелабильной фракции ДНК берут половину исследуемой пробы, то в формулу вводится коэффициент 2, который позволяет учитывать ДНК в целой пробе.

Для определения суммарного количества ДНК в пробе необходимо учесть щелочестабильную и щелочелабильную фракцию ДНК.

С =С +С днк сумм днк щелочестав. дик щелочелаь.

= И,Ь9мкг rs,28 мкг =66,91 мкг.

Количественное определение PHK.

Вторую половину фракции, содержащей смесь PHK и .щелочелабильной ДНК, используют для количественного определения РНК, для чего 4 мл переносят в стеклянную пробирку, закрывают пробкой с каплеуловителем, гидролиэуют на кипящей водяной бане

10 мин, охлаждают, центрифугируют.

Надосадочную жидкость спектрофотометрируют при 270 и 290 нм. Е 1,100

Е29о 0,500.

Количественное содержание PHK определяют по формуле А.С. Спирина (1958) (е27о-е29о) ° 10,5 P рнк

0,19 количество PHK в пробе, мкг; э кстин кци я раствора фракции прн 2 70 им; экстинкция раствора фракции при 290 нм; пересчетный коэффициент для РНК; разность между удельными экстинкциями при 270 и

W0 нм; степень разведения фракции (1,100-0,500> 10,5 . 4

=265, 3 мкг

Коэффициент 2 вводится так же, как и при определении щелочелабильной ДНК, для учета PHK во всей пробе, а не в половине ее, Поскольку во фракции PHK имеется щелочелабильная ДНК, необходимо сделать поправку, вычитая из общего количества PHK щелочелабильную фракцию ДНК.

265,3 мкг — 55,28 мкг = 210, 02мкг.

Для определения количественного содержания ДНК и PHK в клетке подсчитывают концентрацию клеток в бульонной культуре. Подсчет клеток производят в камере Горяева. В данном опыте 1 мл бульонной культуры содержит 351 млн клеток. Учитывая, что для эксперимента взято 25 мл бульонной культуры„ общее количество клеток в пробе составляет 8,78 млрд.

Суммарное количество ДНК в пробе

66,97 10 г, РНК вЂ” 210,02 10 г, ДНК в клетке — 66,97 ° 10 г; 8,78. 10=

-ь — 7 6-10 r, PHK в клетке — 210,02"

@О г; 8,78 . 10 = 23,9 ° 10 г.

Таким образом, предлагаемы способ позволяет более полно и точно отделить ДНК и PHK и в связи с этим учитывать не менее 883 бактериальной

ДНК, вместо 18-623, выявляемых при использовании известного классического метода Шмидта-Таннхаузера.

Формула изобретения

Способ фракционирования нуклеино,вых кислот бактерий, предусматривающий удаление свободных нуклеотидов и липидов иэ клеток бактерий, щелочной гидролиз клеток и клеточной рибонуклеиновой кислоты, осаждение дезоксирибонуклеиновой кислоты и белков из гидролизата, отделение надосадочной жидкости, содержащей рибонуклеотиды, от осадка, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью более полного и точного разделения нуклеиновых кислот на фракции, надосадочную жидкость делят на две равные части, одну из которых обрабатывают этанолом для осаждения дезоксирибонуклеиновой кислоты и осадок гидролизуют кислотой, после чего проводят количественное определение в полученных гидролизатах суммарной клеточной дезоксирибонуклеиновой кислоты, а другую часть надосадочной жидкости гидролизуют и в полученном гидролиэате определяют количе=твенное содержание рибонуклеиновой кислоты.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. J. Schmidt S. Thannhauser

J. of Bioi. chem, 1945, 161, 9 1.

83-89.