Способ получения очищенного протеолитического фермента

Способ получения очищенного протеолитического фермента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

с к@@ ,,с

Союз Советскик

Социал истическик

Республик

-к н и е

ИЗОБРЕТЕНИЯ () 732382

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6!) Дополнительное к авт. свид-ву (22)» алеко 11.07.77 (2 ) 2508436/28-13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 05.05.80. Бюллетень № 17

Дата опубликования описания 07.05.80 (5 I ) M. Кл.

С 12 Il 13/10

С 07 (з 7/028

Государствеииый комитет

СССР ис делен изобретений и открытий (53) УДК 912. .015(088.8) (72) Авторы изобретения

Н. С. Егоров, Т. Г. Юдина и Ж. К. Лория

Московский Ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М. В. Ломоносова (7() Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИШЕННОГО HPOTEGËÈÒH×ÅÑÊ(ÒO

ФЕРМЕНТА

Изобретение относится к способам получения микробиологических препаратов и может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности, медицине, микробиологии.

Наиболее близким по технической сущ5 ности к предлагаемому является способ получения протеолитических ферментов, предус матривающий аэробное культивирование продуцирующего его фермента на !

О питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, осаждение и отделение клеток от культуральной жидкости с последующим диализом и лиофильной сущкой pl), Недостатками способа являются невозможность получения индивидуального целевого продукта, а также нестабильность последнего.

Цель изобретения — обеспечение стабильности фермента и увеличение его выхода.

Бель достигается тем, что в качестве продуцента протеолитического фермента

2 используют Ьс1С1И.оь 1Ьог1пд ет1в1в чаъ

finitlmVS npH этом культивирование проводят глубинным способом з течение

36-48 ч при 28-32"С, à ос.аждение ведут сульфатом аммония при насыщении

0,8-0,9 с последующим диализом и очист кой целевог продукта на сефадексе, продуцент культивируют на сред следующего состава, вес. %: глицерин 0,5-1,5; М Ю4.7Н О 0,010,05; NhSO4 5Н О 0,003-0,008;

СаСО 0,005-0,01; Ъ бО4 7Н О 0,0003Ов0007ь CUSO4 5Н О 010003-0 0007 °

FeSO4-7Н О 0,00002-0,00008;

КдНРО4 0,03-0,07; (NH4)gSOg 0,10,3; Йа лимоннокислый трехзамещенный

0,1-0,3; вода дистилированная — остальное.

Выход целевого продукта составляет

2098 усл.ед/мл фибринолитической актив. ности при культивировании продуцента на синтетической среде и за 3 ч инкубации фибриновой пластинки при концентрации белка 100 мкгlмл. табильность Степен лчистк

Название штамм

Экономичность пособа ктивность ибринолиическая, сл. едрил

Стабилен

Не стабилен

Целевой продукт представляет со бой индивидуальный и стабильный фермент.

ВаюИоь 11 ог у1еп- 2098

5Фь маг- ЬпЖтц ь или 839

Кс,Аюот сe,s И еv- 650 ъюи Ся ap1%

Высокая фибринолитическая активность целевого продукта наблюдается при вырацивании продуцента на обеих приведен- 25 ных средах.

Мелевой продукт, образуемый предлагаемым штаммом-цродуцентом - один фермент, не требующий дальнейшей очист30 ки и какой-либо обработки, отличакмцийся также от известного высокой стабильностью. Причем, он сохраняет свою актив.ность при значительном нагревании и при длительном хранении в лнофилизованном состоянии, не требуя цри этом, например иммобилизации.

Штамм ЬомЫчя М ю"мщ4вьЫв чанг %imt vs был выделен в Канаде в 1958 гоцу и хранится в коллекции ВНИИ При- щ кладной микробиологии.

Штамм Иск:щадя Ц ог п тя„ iв 1цх .gz.

Млтиъ имеет следующие морфологические и физиолого-биохимические характеристики. 45

М орфологи ч еские с в о и с т в а . Клетки односуточной культуры палочковидные, удлиненные, с тупыми краями, часто соединены в цеI почки. Размер клеток 7-10 мкм, длина ф6

l,5, ширина 3 мкм.

Культура образует крупные овальные споры я округлые, мелкие параспоральные, кристаллы, соединенные со спорами. Клет ки неподвижны. Грампопожительные.

К ультуральные свой- с т в а . Культура Влс Юиь фут-юремМе оси.. 9т Члт ое образует беловатую пленку на мясо-пептонном бульоне я (%вспенили» и< стд6и i>.;íñê:ти фер..и нтн и увеличение его выхода представлено в таблице.

Один Выращивание лрофермент - дуцента на дешевой синтетической среде илн на сложной среде, идущей в отходы производства

Комплекс Выращивание различных продуцента на ферментов среде, содержащей крахмал, растворимый среде с сахарозой. На мясо-пептонном и молочном arape штрих обильный, беловатого цвета, вязкой консистенции. Колонии на мясо-пептонном агаре через 3 сут. имеют правютьную округлую форму беловато серого цвета, тиоскйе, непрозрачные, со слегка волнистым краем, однородные.

Физиолого-6иохи ми— ч е с к и е с в о и с т в а . Культура

ЦСКЛИОЭ Ч11Л ЩК41ЯЯ ЧОГ. KÌ1 1\ÚU9 разжижает желатину, гидролизует альбумы, казеин, фибрин, фибриноген.

ЬС1С1ИОЬ UlQT 1l1pCYI549 ЧС%Г &ММУХ мезофил, оптимальная температура для его развития 28-30 С, диапазон значений рН 7-8-9, оптимальное значение рН7„8.

Огношение к углеводам: использует глюкозу с образованием ацетилметилкар:бинола, сахарову, целлобиозу, не исполь- ° зует крахмал, маннозу.

Орошение к спиртам: усваивает сор-э«ит, глицерин.

Огношение к органическим кислотам усваивает сукцинат, лактат, цитрат.

Отношение к источникам азота: ассимилируея аммоний сернокислый и другие аммонийные соли, усваивает глютамат, глютамин, аспартат, аспарагин, глицин, валин, пролин, аргинин, орнитин.

В синтетическую среду состава, r/%; глицерин 1%; NgSO< 7Н О 0,03%;

МпВО 5Н О 0,0059о, СаСВд 0,008%;

Xh&Og 7НкО 0,0005%, СО%Од 5Н О

0,0005% FeSO< 7Н О 0,00005%;

К НРО 0,05% (N t ai)< 5O 0,2".. Чи имоннокислый трехзамешенный 0,2":

5 7323 (рН среды. 7,2) после стерилизации вносят 5 4 по объему 1-2-суточного посевного материала Вас1Кць thUFinp10nsis 4аг.

БпА иоь, выращенного на этой же среде после смыва с 2-суточных косяков молочного агара. Культивирование осуществляют глубинным способом в колбах на 250 мл с 50 мл среды на качалке, например фирмы GaHenkapf.", Англия при 28-32 С в течение 2 сут.

Из культуральной жидкости (клетки отделяют при 6000 об/мин втечение

10 мин) выделяют rtpenapaT протеазы путем высаливания сернокислым аммонием до насыщения 0,9, оставляя его для бо- 15 лее полного высаливания на 24 ч при 4 С.

Выпавший осадок, содержащий протеолитический фермент, очищают от ионов сульфата аммония íà колонке фирмы Фармация (50y600 см) с сефадексом -25 о (пасйим ). Киализованный препарат имеет фибринолитическщо активность 2098 усл. ед/мл Dpl концентрации белка 100 мкг/мл за 3 ч ижубации фибриновой пластинки.

Преимушества предлагаемого способа 25 по сравнению с известными заключаются в получении гомогенного стабильного очищенного фибринолитического фермента, в повышении экономичности способа, в увеличении выхода целевого продукта, а так- ЗО же в воэможности использования для получения целевого продукта среды, йдущей в отходы микрббиологического производства.

Фор мула изобретения

1. Способ получения очищенного про еолитического фермента, предусматри- 40 ваюший аэробное культивирование проду.цирующего его фермента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и шнеральных солей, осаждение и отделение клеток от хультуральной жидкости, с последующим диализом и лиофильной сушкой полученного фермента, г отличающийся тем, что, с целью обеспечения стабильности фермента и увеличения его выхода, в качестве продуцента используют штамм BaciHus

О,.И огмнредМэ айаг-ЮММтоя, при этом культивирование проводят глубинным способом в течение 36-48 ч при 2832 С, осаждение ведут сульфатом аммония при насыщении 0,8-0,9 с последующим диализом и очисткой целевого продукта на сефадексе.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что продуцент культивируют на среде следующего состава, вес. %:

Глицерин 0,5-1,5 йфбО 7Н О 0,01-0,05

e so нг О,003-0,,008

Ссфс С 0,005-0,01

7д О -lH 0 0,0003-0,0007

Ci)so 5H О 0,0003-00007

pe So . 1н о 0,00002-0,00008

К НР 0,03-0,07 (НЙ41х О4

0,1-0,3

Я а лимонйокиелый трехзамещенный 0,1-0,3

Вода дистилированная Остальное

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Выборных С. Н., Егоров К. С.

Изучение препарата протеолити;еских ферментов термофильного актиномицета .

Actinomces Л егвочоЕ рг штамма

-54. Ïðèêëàäíàÿ биохимия к микробиология, 1975, т. ХХ, вып. 6, с. 829ВЗЗ (прототип).

Составитель И. Привалова

Редактор М. Недолуженко Техред Н- Бабурка Корректор И. Муска

Заказ 1543/7 Тираж 522 Подписное

БНИИПИ Государственного комитета СССР ло делам изобретений и открытий

L13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фили»:: ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная 4