Способ идентификации микроорганизмов-вредителей пивоваренного производства

Способ идентификации микроорганизмов-вредителей пивоваренного производства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (iii732386

Союз Советскик

Социалистичвскик

Республик (61) Дополнительное к авт. свил-ву (51)M. Кд.

С 12 К 1/00 (22) Заявлено 12. 12.77 (21) 2553728/28-13 с присоединением заявки ¹

Гасударственный кемнтет

СССР (23) Приоритет

Опубликовано 05.05.80. Бюллетень № 17 ов делам кзобретеннк и еткрыткй (53) УДК 663. . 18(088.8) Дата опубликования описания 07.05.80 (72) Автор изобретения

А. A. Березовский

Харьковский филиал Всесоюзного научноисследовательского института пиво-безалкогольной промышленности (7l) Заявитель (54) СПОСОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ

МИКРООРГАНИЗМОВ-ВРЕДИТЕПБЙ

ПИВОВАРЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА

Изобретение относится к пивоварен» ной промышленности, в частности к спс собам идентификации микроорганизмоввредителей и может быть использовано в винодельческой, дрожжевой, консервной

5 и безалкогольной прочыш тенности.

Известен способ .идентификации нжкроорганизмов-вредителей пивоваренного цроизводства, предусматривающий посев исследуемого образца на селективную питательную среду, культивирование микроорганизмов и их идентификацию )lj.

Недостатком известного способа является длительность и сложность процесG8»

1$

Gemü изобретения - интенсификация и упрощение пропесса.

Бель достигается тем, что после куль тивироваиия: микроорганизмы отделяют от питательной среды центрифугированием, промывают 0,85%-ным раствором хл ристого натрия и разводят их до концентрации 1-2 млрд. микробных тел в 1 мл, а идентификацию проводят путем внесения пробы раствора в набор иммунных сывороток, полученных иммунизацией животных штаммами микроорганизмов-вредителей и по реакции агглютинации судят о виде или группе микроорганизмов, причем перед иммунизацией сыворотки инактивирук." - ри 56-60 С 40-45 мин и выделяют из них глобулиновую фракцию путем обработки их насышеннымраствором сернокислого аммония, а перед пдентификапией сыворотки разводят 0,85% ным раствором хлористого натрия до

3/4 их титра.

Исследуемый образец высевают на жидкие селективные питательные среды и культивируют микроорганизмы, после чего отделяют их от питательной среды центрифугированпем. Осадок микроорганизмов промывают 0,85%-ным раствором хлористого натрия (т(аСс }, разводят его до концентрации 1-2 млрд. микробных тел и 1 мл и проводят идентификацию их.

Для чего пробу раствора вносят в набор иммунных .сывороток, полученных имму3 73 низацией животных штаммами микроор анизмов-вредителей, при этом сыворотки разводят 0,85%-ным раствором хлористого натрия до 3/4 их титра и по реакции агглютинации судят о виде или груше микроорганизмов, содержащихся в исследуемом образце.

Перед иммунизацией сыворотки инактивируют при 56-60 С 40-45 мин и выделяют из них глобулиновуhî фракцию путем обработки их насыщенным раствором сернокислого аммония, вводимого в них при перемешивании. Центрифугируют смесь и жидкость отбрасывают,. осадок растворяют дистиллированной Водой. K раствору прибавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и повторяют операции, описанные ьыше.

После этих операций сыворотка содержит очищенный глобулин. Очищенные сыворотки используют для идентификации микро организмов.

Пример. Исследуемый образецсусло высевают на жидкую селективную питательную среду, в которую для подавления рта дрожжей добавляют антибио-тик актидион или нистатин и выращивают

1 при ЗО С 18 часов до заметного изменения жидкой среды (помутнение, образование пленки или осадка).

Среду центрифугируют, отделяют ссадок, промывают его физиологическим раствором 0,85%-пьем раствором ИаС8 и раз-водят до концентрации 2 млрд. микробных тел в 1 мл по бактериальноцу стандарту мутности.

Полученные таким образом взвеси а,-ного или нескольких видов микроорганизмов, находящихся в исследуемом обряде, готовы к идентификации.

Для обнаружения микроорганиз ..логвредителей и их идентификации примен::- .,Ст набор специфических имунных сывороток,, полученных иммуя зацией животных антигенами соответствующих видов . и.::=роорганизмов.

ДНтИГЕyrr I ДЛЯ ИММУНИЗаЦИИ ГетОВЯт следующим образом.

Типовые культуры микрооргавизмоввредителей рода дс оЩ р:.- ив РвД4осос-

cuS, Ас е о ЬасАег, 7блжЪос ег.царю, Асят-а.— моЬОс1м" высеивйют на твердые питйтепьные среды, обеспеч п ающие xopo-mee накопление биомассы, и выращивзают

48 ч при SQОС.

Накоплеьшую биомассу бактерий смывают физиологическим раствором и иентри2386

ФУ I р5 ют.. 0садок трижды громывают физиологическим раствором и разводят пс концентрации 100 млн/мл, Пол5,— íные суспензии бактерий прогревают при

60 С 40 мин. На этом приготовление а нтигена для им мунизации заканчивается, Способ иммунизации заключается в пятикратном введении в краевую вену уха кролика (весом 3 кг) BGGpañòàþtHHõ доз антигена с интервалом 4 дня в количестве„мл: 0,5, 1,.0, 1,5, 2, 4. .Иммунизацию можно проводить и любым другим известным способом. Спустя

7 дней после последней инъекции животных обескровливают и отделяют сыворотку крови. Для этого кровь, собранную в стерильные пробирки, ставят на 40 в термсстат прп 37 С, а затем в холо0 дильник гри 4 С на 4 ч. После полного . отделения сыворотки от сгустка крови ее отоa-..ывают пастер овской пипеткой.

Для лучшего хранения сыворотки фильтруют через бактериальнь|й фильтр Зейтца.

Полученные сыворотки содержат антитела, отличительной особенностью которых является способность образовывать специфические соединения с соответствующими антигенами (в данном случае микроорганезм, который использовался для иммуни. и зации). На этом принципе и основаны серологические реакции "аптиген-антитело ;

Антитела относятся к глобулиновой фракции сыворотки, поэтому для усиления специфических свойств антисывороток

:з них выделяют глобулиновую фракцию следующим образом. Готовят насыщенный раствор сернокис=лого аммония в дистиллированной воде при комнатной температуре.

4в

К определенному количеству сыворотки добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония при температуре холодильника. Раствор сернокислого аммония добавляют медленно пипет45

HBò7, непперывно размешивая сыв(ротку

4ентрифугируют смесь при 4000 об/мин

30 мин. Кадосадочную жидкость отбрасывают.

Ссадок рас -воряют> медленно добавляя дистиллированную вод5 . Гсли осадок содержащий глоб улин плохо растворяется, тогда используют воду с рН 7,5.

K раствору глобулина прибавляют рав55 ный объем насыщенного раствора сернокислого аммония и повторяют операции, описываемые выше.

После трех осВжден1лй сыворотка ооьГч но содер ддт очищенный глобулнн.

5 732

Растворенный глобулин диализируют о при 5 С против физиологического раствора, который часто меняют. Диализ продолжают до тех пор, пока внешний раствор, оставленный на 12 ч, не будет содержать следов сернокислого аммония (пробе на сульфатные анионы с хлористым барием).

Очищенные описанным образом сыворотки титруют.

Титром сыворотки считают конечное разведение сыворотки, при котором еще происходит отчетливая реакция, антигенантитело".

Для идентификации микроорганизмов до 15 вида разводят сыворотку физиологическим раствором 0,857-ным раствором gaC8 до 3/4 ее титра, так как при этом будет исключаться возможность неспецифических реакций. го

Для обнаружения и идентификации микроорганизмов-вредителей используют серологическую реакцию агглютинации.

Для постановки реакции агглютинации берут ряд стекол (по числу имеющихся сывороток и на поверхность хорошо обезжиренного предметного стекла наносят

2 капли сыворотки и каплю физиологического раствора.

Затем в каплю физиологического раст- З0 вора (контроль антигена) и в одну из капель агглютинирующей сыворотки вносят исследуемую бактериальную суспензию (антиген). Ко второй капле (контроль сыворотки) культура не добавляется. Внесенную суспензию тщательно перемешивают, чтобы капля жидкости сделалась равномерно мутной. Реакция цротекает. при комнатной температуре, но лучше реакция о 40 протекает при подогреве до 37 С., Результат учитывают с помощью лупы или микроскоца через 10 мин.

При положительной реакции в капле с сывороткой отмечается скучивание бак45 терий в виде зернышек или хлопьев, хорошо видимых при покачивании стекла.

Жидкость в контроле антигена должна быть равномерно мутной, а в контроле сыворотки прозрачной, Положительная реакция агглютинации свидетельствует о присутствии в иссле386 6 дуемых образцах определенных видов или групп микроорганизмов, се ответствующих применяемым сывороткам.

Использование предлагаемого способа идентификации микрооргапизмов-вредителей пивоваренного производства обеспечивает по сравнению с известным способом значительное ускорение и упрощение видовой и родовой идентификации бактерий.

Так, для видовой идентификации бактерий по культурально-морфологическим и физиологическим свойствам требуется 2-3 недели, а для идентификации серологическим методом "антиген-антитело" 30-40 мин.

Формула изобр етения

Способ идентификации микроорганизмоввредителей пивоваренного производства, предусматривающий посев исследуемого образца на селективную питательную среду, культивирование микроорганизмов и их идентификацию, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью интенсификации и упрощения процесса, после культивирования микроорганизмы отделяют QT питательной среды центрифугированием, промывают 0,857-ным раствором хлористого натрия и разводят, их до концентрации

1-2 млрд. микробных тел в 1 мл, а идентификацию проводят путем внесения пробы раствора в набор иммунных сывороток, полученных иммунизацией животных штаммами микроорганизмов-вредителей и по реакции агглютинации судят о виде или группе микроорганизмов, причем перед иммунизацией сыворотки инактивируют при о

56-60 С 40-45 мин и выделяют из них глобулиновую фракцию путем обработки их насыщенным раствором сернокислого аммония, а перед идентификацией сыворотки разводят 0,85!о-ным раствором хлористого натрия до 3/4 их титра.

Источники информации, принятые во внимание гри экспертизе

1. Жвирблянская А. Ю., Бакушинская О. A....

Микробиология в пищевой промышленности, M., 1975, с. 147-161.

UHHHHH Заказ 1543/7 Тираж 522 Подписное

Филиал ППП Патент", r. Ужтород, ул. Проектная, 4