Способ получения глюкуронидазы

Способ получения глюкуронидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП-ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Соы1ивлистических

Республик »733685 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 01.06.78 (21) 2623042/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М. Кл.

А 61 К 37/00

Государственный комитет

СССР

Опубликовано 15.05.80. Бюллетень № 18

Дата опубликования описания 25.05.80 (53) УДК 615.45:

:615.7 (088.8) во денем изобретений н отярытнй (72) Авторы изобретения

М. Я. Берга и Т. Ф. Фридман (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ р-ГЛЮКУРОНИДАЗЫ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к способам получения ферментных препаратов, используемых в биохимических и медицинских исследованиях.

Известен способ получения д-глюкуронидазы из экстракта измельченной печени фракционированием в ацетатном буфере рН 5,0, аутолизом при 38 С в течение 8—

10 ч, отделением осадка центрифугированием, обработкой ацетатным буфером, добавлением сульфата аммония и выделением целевого продукта в смеси ацетон-вода в соотношении

1: 2 (1).

Однако известный способ не обеспечивает получения препарата с высокой активностью (активность препарата 100000 — 120000 ед/г).

Целью изобретения является повышение активности препарата.

Это достигается тем, что по предлагаемому способу экстракт обрабатывают водой, центрифугируют, осадок обрабатывают водой, раствор диализуют и лиофилизируют. zp

Пример 1. Свежую печень измельчают на мясорубке. В реактор с мешалкой загружают 10 кг фарша и смешивают с 7,5 литрами 0,2 М ацетатного буфера рН 5,0. Смесь

2 выливают в кастрюлю и выдерживают 20 ч в термостате при 37 С. Осадок отделяют центрифугированием íà «Mistral» при

2500 об/мин в течение 30 мин при 15 — 20 С.

Фермент содержится в центрифугате. Осадок промывают 3,5 л 0,2 М ацетатного буфера рН 5,0, снова центрифугируют при 2500 об/мин, 30 мин при 15 — 20 С. Экстракты соединяют.

Общий объем центрифугата около 18 литров.

Осадок выбрасывают.

К 18 л экстракта при перемешивании добавляют 6 кг сухого сульфата аммония из расчета 0,334 кг на 1 л экстракта при

15 — 20 С.- Перемешивание продолжают еще

30 мин до полного растворения сульфата аммония. Раствор выдерживают 12 ч при

0 — 4 С без перемешивания. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при

2500 об/мин 30 мин, тепмпература 0 — 4 С.

Центрифугат отбрасывают. Осадок промывают 5 л 23,2%-ного раствора сернокислого аммония, охлажденного до 0 — 4 С и центрифугируют при 2500 об/мин в течение 30 мин при 0 — 4 С.

Промытый осадок растворяют в 2 л деминерализованной воды и для лучшего растворения суспензкю выдерживают в термо733685

Формула изобретег ия

Составитель С. Малютина

Техред К. Шуфрич Корректор М. Вигула

Тираж 673 Подписное

Редактор Л. Батанова

Заказ 1939/8

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП <Патент» г. Ужгород, ул. Проектная, 4 стате при 37 С 2 ч. Нерастворившиеся примеси отделяют центрифугированием при

2500 об/мин в течение 40 мин при 10 — 20 С.

К раствору f3-глюкуронидазы около 2,2 л при постоянном перемешивании прибавляют

1 кг (350 г/л) сульфата аммония и оставляют на 12 ч при 0 — 4 С. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при

2500 об/мин и 4 С в течение 40 мин. Фильтрат отбрасывают. Осадок растворяют в 1 л воды и центрифугируют. Центрифугат диализуют в течение 4 сут и лиофильно высушивают. Выделенный препарат имеет активность 312000 е/г.

Выход — 60 r.

Осадок после последнего центрифугирования растворяют в 0,5 л воды и отделяют примеси центрифугированием. Центрифугат диализуют в течение 2 сут и лиофильно высушивают.

Активность — 192000 е/г.

Выход — 30 г.

Пример 2, 8 кг печени гомогенизируют с 6 л 0,2 М ацетатного буфера рН 5,0 и гомогенат оставляют на автолиз в течение

20 ч при 37 С. Автолизат центрифугируют.

Осадок промывают ацетатным буфером рН 5,0 и центрифугируют. Центрифугаты объединяют 16 л.

К 16 л экстракта прибавляют сульфат аммония из расчета 0,334 кг на) и экстракта и через 12 ч выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок промывают

4 л 23,2о/о-ного РаствоРа сеРнокислого аммония и центрифугируют. Центрифугаты отбрасывают.

Осадок, содержащий фермент ф-глюкуронидазы, растворяют в 0,9 л дистиллированной воды и центрифугируют. Центрифугат и осадок обрабатывают отдельно. Водный раствор диализуют в течение 5 сут и лиофильно высушивают. Активность выделенного препарата 320000 е/г.

Выход — 50 г.

Осадок после центрифугирования растворяют в 0,7 л воды и центрифугируют.

Полученный раствор диализуют и лиофильно высушивают.

Активность выделенного препарата

100000 е/г.

Выход 30 г.

Предлагаемый способ обеспечивает улучшение качества ферментного препарата

/З-глюкуронидазы, который широко используется в медицинских и биохимических исследованиях. Очистка препарата от примесей предотвращает инактивацию и обеспечивает повышение активности и чистоты ф-глюкуронидазы в 3 — 5 раз. Использование такого препарата не требует присутствия активатора — ДНК. Исключение ацетона создает безопасность условия труда. го

Способ получения f3-глюкуронидазы путем экстрагирования измельченной печени, выдерживания в ацетатном буфере, отделения осадка, обработки его ацетатным буфером и высаливания сернокислым аммонием, отличающийся тем, что, с целью повышения активности, экстракт обрабатывают водой, зп центрифугируют, осадок обрабатывают водой, раствор диализуют и лиофилизируют.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Крехова М. А. Проблемы эндокринологии и гормонотерапии. 1960, т. 6, № 2, с. 55 — 63.