Способ выделения рибонуклеазы

Способ выделения рибонуклеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О 4 Й Кз 1 и й . ; к., С©юз Соаетсииж

Социалистическик

Республик

ИЗОБРГ ЕНИЯ

@ мто Рско му сеиде еиьстиу (61) Дополнительное;«, ввт. свид-ву (22) Заявлено 11,04 7 {21) 2473397/28-13 с присоединением Заявки Ио (23) Приоритет

С i2 В i3/i0

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий

1 50580 апоян-.р, ЦО 1 8

Дата опубликованы.-.:- Q èñàèê5: 1805.80 (53) УДКббз.is (088. 8) (72) Авторы изобретения

B.А. Ежов, А Г. Приходько, И О. Лишевская и Б П. Морин (71) Заявитель

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗЫ

Изобретение относится к микробио логической промышленности, а именно к способу выделения рибонуклеазы, используемой в пищевой промышленнос5 ти для удаления РНК иэ белкововитаминных концентратов и. улучшения их пищевой ценности, в медицине, а так— же в биохимических синтезах полинуклеотидов и их исследованиях, изучения. строения рибонуклеиновых кислот и белков.

Известен способ выделения и очистки щелочной РНКаэы из культуральной жидкости Penicil8ium brevicompactum,: согласно которому для получения щелочной РНКазы из культуральной жидкости осаждают ферменты сульфатом аммония при 0,9 насыщении, осадок отделяют на суперцентрифуге, растворяют, повторно центрифугируют и диализуют, Раствор после диализа очищают хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, KM-целлюлозе и сефадексе G-75. Перед каждой стадией хроматографии растворы с ферментом концентрируют и диализуют.

Концентрат щелочной РНКаэы хранят при +4 С или при -5 С в глицерине(1). о

Известен способ выделения рибонуклеазы иэ культуральной жидкости Зд

Реп хсзр Cium . brevicompactum,. являющий" ся наиболее близким техническим решением к изобретению, предусматривающий хроматографирование культуральной жидкости, ультрафильтрацию полученного элюата и диализ (21.

Однако известный способ предусматривает голучение только кислой рибонуклеа = ы, прн этом способ является

-:,àF .ð ".орным л не позволяет получить большие количества. фермента.

Целью изобретения является разработка промышленного способа получения кислой и щелочной рибонуклеазы. в одной технологической схеме, повышение степени их чистоты, упрощение процесса и повышение выхода целевого продукта .

Поставленная цель достигается тем, что хроматографирование культуральной жидкости осуществляют в три стадии, на первой иэ которых культуральную жидкость пропускают через последовательно установленные среднеосновной и высокоосновной аниониты, после чего злюат концентрируют ультрафильтрацией и диалиэуют, на второй стадии полученный раствор хромйтографируют на KN-целлюлозе, концентрируют ульт734261 рафильтрацией и диалиэуют, затем на третьей стадии проводят гель-хроматографию на сефадексе G-75 с получением двух фракций, одну иэ которых, содержащую кислую рибонуклеазу, диализуют и сушат, а другую — щелочную рибонуклеазу — концентрируют ультрафильтрацией и кристаллиэуют диализом.

При этом в качестве среднеосновного анионита используют смолу ЭДЭ-10П в С1 -форме, а в качестве высокоосновного анионита — анионообменное волок.но ЦМ-А2 в CE -форме.

Сущность способа заключается в следующем.

ОтфильтРованную культуральную жидкость Penici5 tium brevicompactum пропускают с высокой скоростью сначала через колонку со среднеосновным анионитом, например ЭДЭ-10П, где удаляются сильнокислотные примеси, затем через колонку, заполненную высокоосновным анионообменным волокном на целлюлозной основе, например

ЦМ-А2. Насыщенную ферментом колонку промывают водой и десорбируют ферменты 0,5 í. NaCC в 0,1 н. ацетатном 25 буферном растворе с РН-5,0. Активные элюаты концентрируют ультрафильтрацией, диалиэуют, хроматографируют на

КМ-целлюлозе и сефадексе G-75. После сефадекса G-75 получают гомогенные фракции кислой и отдельно щелочной рибонуклеаэ. Выход растворов кислой

РНКазы составляет 50-60%, а щелочной

РНКаэы 26-30%.

Затем раствор щелочной РНКазы диалиэуют против 0,01 н. трис-ацетатного буферного раствора с РН-3,5. При диализе щелочная РНКаза выкристаллиэОвывается. Кристаллы фильтруют и сушат под вакуумом. раствор кислой рнказы диализуют 40 против 0,01 н. трис-HCt буферного раствора с РН-7,0 и сушат лиофильно, как обычно.

Пример. 260 л отфильтрованной культуральной жидкости с тем- 45 пературой 4-6 С пропускают со скоростью 100 л/ч через колонку (80x200 cM) с 8 кг анионита ЭЛЭ-100 (СС -форма) .

Затем раствор подщелачивают до g0

РН-7,1 и пропускают со скоростью

90 л/ч через колонку (20x130 см) с

5 кг анионообменного волокна ЦМ-А2 (С3 -форма). Колонку промывают 100 л дистиллированной воды с той же скоростью, Десорбцию ведут 0,5 í. NaCK в 0,1 н. ацетатном буферном растворе с РН-5,0 со скоростью 5 л/ч. Активные элюаты (30 л) концентрируют при рН-7, О на ультрафильтре с мембранной УАМ-100 при давлении 2 атм.

Получают 500 мл концентрата, который диалиэуют через целлофан против

0,01 н. трио-ацетатного буфера с

РН-4,5. Раствор наносят на колонку (10x50 см) с КМ-целлюлозой, их промывают 0,01 н. трис-ацетатным буфером с РН-4,5 и элюируют ферменты линейным градиентом ИаСС от О до 1 н. в 0,01 н. трис-ацетатном буфере с

РН-4,5 со скоростью 100 мл/ч. Полученные 1000 мл активных фракций концентрируют ультрафильтрацией, диализуют и наносят на колонку (3x100 см) с сефадексом G-75. Элюцию ведут

01 н. КС в 005 н. трисНСГ буфере с РН-7, 5 со скоростью 60 мл/ч.

Получают 200 мл фракции, содержащей кислую РНКаэу и 210 мл фракции, содержащей щелочную РНКазу. Препараты электрофоретически гомогенны и не проявляют ФМЭ-азнрй, ФДЭ-азной и

ДНК-азной активности. Раствор кислой

РНК-аэы диализуют против 0,01 н. трис-HCC буфера с рН 7,0 и сушат лиофильно, как обычно.

Раствор щелочной PHK-аэы концентрируют ультрафильтрацией до 10 мл и диалиэуют против 0,01 н. трис-ацетатного буфера с РН-3,5. В процессе диалиэа выпадает кристаллическая соль щелочной РНК-аэы, которую отфильтровывают и сушат в вакуум-сушильном шкафу беэ нагрева. Получают

500 мг кристаллического порошка с выходом 26,0Ъ от содержания щелочной

PHK-аэы в культуральной жидкости

В таблице даны следующие этапы очистки предлагаемым способом:

1) осаждение сульфатом аммония, центрифугирование, растворение осадка, центрифугирование;

2) диализ, гель — хроматографии на G-100;

3) ультрафильтрация, диализ, хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе;

4) ультрафильтрация, диализ, хроматография на КМ-целлюлозе; известным способом:

1) очистка на ЭДЭ-10, сорбция, десорбция на ЦМ-2, ультрафильтрация;

2) диализ. хроматографии на

КМ-целлюлозе;

3) ультрафильтрация, диализ, гель-хроматография на G-75.

В таблице приведены данные указанного примера в сравнении очистки кислой рибонуклеазы с литературными данными известного лабораторного метода получения кислой рибонуклеазы.

734261

Эта очи ст

Ф

Исходный раствор

6500 260000

101 500

294 1000

304 210

78,8

0,252 5,2

0,287 4,5

0,231 3,3

0,148 2,8

О, 108

2,3 0,6

12,5 20,8

592 606

100

100

113,5

92,0

58,8

43,0

86,5

63,0

1320 2300

1980

54,0

Формула изобретения

Составитель М. Ларина

Редактор Н. Потапова Техред И.Асталош Корректор С..Шекмар

Тираж 522 Подписное цНИИПИ ГоСударственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 2130/ЬО филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Применение предлагаемого метода позволяет одновременно получать оба фермента в одном технологическом процессе, повышенной степени чистоты, значительно упростить технологическую схему и повысить выход кислой

РНК-азы до стадии диалиэа и сушки в

=реднем на 12% против известного лабораторного способа, Предлагаемый способ позволяет получать большие количества ферментов в промышленных условиях. ЗО

1. Способ выделения рибонуклеазы 35 иэ культуральной жидкости Peniciktium

brevicompactum, предусматривающий хроматографирование культуральной жидкости, ультрафильтрацию полученного элюата и диалиэ, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью одновременного выделения кислой и щелочной рибонуклеаэ, повышения степени их чистоты, упрощения процесса и увеличения выхода ферментов, хроматографирование культуральной жидкости осуществляют в три стадии, на первой иэ которых культуральную жидкость пропускают через последовательно уста новленные среднеосновной и высокоосновной аниониты, после чего злюат концентрируют ультрафильтрацией и диалиэуют, на второй стадии полученный раствор хроматографируют на

КМ-целлюлозе, концентрируют ультрафильтрацией и диализуют, затем на третьей còàäèè проводят гель-хроматографию на сефадексе G-75 с получением двух фракций, одну иэ которых, содержащую кислую рибонуклеазу, диализуют и сушат, а другую — щелочную рибонуклеазу — концентрируют ультрафильтрацией и кристаллизуют диалиэом.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве средиеосновногo анионита используют смо-. лу ЭДЭ-10П в СЕ -форме, а в качестве высокоосновного анионита — анионообменное волокно ЦИ-А2 в Ct -форме.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Прикладная биохимия и микробиология, 1974, т. 5, вып. 3, с. 432.

2. Прикладная биохимия и микробиология. 1972, т. 8, вып. 2, с ° 226 (прототип) °