Штамм вкм-а591-продуцент холестериноксидазы

Штамм вкм-а591-продуцент холестериноксидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскнк

С оцналнстнческнк

Республнк

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ юмв. .л ю звт

ВПТБ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.ЮВ (51}М. Кл.2 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено210278 (21) 2588999/28-13 с присоединением заявки ¹

С 12 0 13/10

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 150580, Бюллетень ¹18 (>3} >4К 577.15. .07(088.8) Дата опубликования описания 150580 (72) Авторы изобретения

A.À. Имаенецкий, В.Х. Козлова, T.Ñ. Назарова, Л.Е. Никитин и Г.A. Ииршова (71) Заявитель

Институт микробиологии АН СССР (54) IIITANM AC II80NVCP5 LAVI .ADULATE ВКИ-А591—

-ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАВЫ

Изобретение относится к области микробиологйческого синтеза фермен тов и касается получения штаммов, продуцирующих холестериноксидазу. .Холестериноксидаэа, катализирующая превращение холестерина согласно уравнению:

+О д4 холестенон+ может быть применена в препаративной медицинской биохимии для количественного определения холестерина, в крови. Применение ферментного препарата в лаборатЬрных клиничес ких анализах позволит значительно ускорить проведение анализов крови . 15 на холестерин.

Известно, что многие микроорганизмы способны использовать холестерин в качестве единственного источника углерода. В ряде случаев было 2р показано превращение холестерина в холестенон с помощью ферментных препаратов, полученных из различных микроорганизмов.

В настоящее время для получения . 25 холестериноксидаэы используются преимущественно микроорганизмы рода Nocardia которые выра. щиваются на средах, содержащих холестерин. 30

Наиболее близким по своей технической сущности к изобретению является штамм-продуцент холестериноксидаэы, относяшийся к виду Р -oQctino>nvcе.=

ervthropoI is (1) .

Холестериноксидаэа является внутриклеточным ферментом, поэтому для ее получения клетки микроорганизма-продуцента должны быть разрушены.

Клетки нокардий и проактиномицетов трудно разрушаются, так как их клеточные стенки содержат большее количество восков и липидов по сравненйю с другими микроорганизмами.

Целью изобретения является штамм актиномицетов Acbnomvce ЧочепсКФое

ВКМ-А591, образующий внутриклеточную холестериноксидазу. При выращивании Actinomvces 1ove uQBe на простой среде в течение 20 — 22 ч образуется до 2 г/л сухой биомассы с удельной активностью 1,5 ед/г. Иицелий Actinornvces fnve nс о с е разрушается значительна легче, чем клетки нокардий и проактиномицетов.

Кроме того, Achinornvces очепЛоРое обладает антибиотической активностью, что предотвращает. заражение культуры при выращивании в больших объемах.

734264

Биомассу, дважды промытую соля<иокислым трис-буфером рН 7,9 с добавлением ЭДТА (500 мг на 100 мл), раэ40 рушают в замороженном виде под давлением 4000 кг/см . Фермент экстра гируют тем же буфером в течение 24 ч при 5 С и разрушенные клетки удаляют центрифугированием при 20000д в течение 30 мин. Иэ полученного центрифугата ферментный препарат получают высаливанием сульфатом аммония при насыщении 0,7. Выход холестериноксидаэы составляет 1„5 Е

50 на 1 r сухой биомассы (удельная активность препарата 0,04 Е/мг белка).

При этом одна единица активности (1 Е) соответствует образованию

1 мкмоля холестенона в 1 мин при

37 С в следующей реакционной смеси:

2,80 мл 0,5 М фосфатного буфера, рН 7,0; 0,15 мл раствора холестерина в зтаноле (с = 3,86 мкг/мл), 0,03 мл

2-твин-20 (с = 0,5t), 0,02 мл экстракта мицелия актиномицета.

Сопоставление предлагаемого штамма с продуцентом холестериноксидазы

Prc

Предлагаемый штамм был выделен иэ окультуренной почвы Подмосковья,,селекционирован и идентифицирован как Actinom cea ачепс1о9ое

ВКМ-А591 Штамм хранится во Всесоюзной коллекции непатогенных микро5 организмов ИНМИ AH СССР, Морфология. Типичный актиномицет, . имеющий разветвленный мицелий,около

1 мкм в поперечнике. Спороносцы с примитивными спиралями около 0,5 витка, расположены одиночно. Споры овальные с гладкой оболочкой.:

Культуральные признаки. На агаризованной глюкозоаспаргиновой среде, применяемой для получения активной биомассы,при посеве на чашки Петри 15 ,образуют круглые выпуклые колонии с приподнятым центром .Окраска воздуш- ного мицелия в центре колоний сероватороэовая (цвет лаванды),по периферии серая. Субстратный мицелий темно- 20 бурого цвета. На картофельном агаре образуются выпуклые колонии до

100 мм в диаметре с воздушным мицелием светло-серого или белого цвета.

Субстратный мицелий светло-бурый.

Вокруг колоний на картофельном агаре часто образуются бурые зоны из выделяемых в среду меланоидных пигментов. На ломтиках картофеля колонии складчатые, воздушный мицелий

30 скудный, серого цвета, Картофель буреет ° На масло-пептонном бульоне образует на поверхности пристеночное кольцо, затем хлопья, выпадающие в осадок.

Хорошо растет на глюкозо-дрожжевой среде, образуя колонии до 10 мм в диаметре белого или сероватого цвета; воздушный мицелий хорошо развит на

5 сут. по всей поверхности колоний, . образуется бурый пигмент, выделяемый в среду.

На среде СР-1 Красильникова растет очень хорошо, колонии крупные " (до 13 мм в диаметре на 8-10 сут), воздушный мицелий серого или серовато-коричневого цвета хорошо развит по всей поверхности колоний, нижняя сторона колоний темно-бурого цвета.

На среде Чапека с глюкозой растет плохо, образует мелкие (до 5-7 мм в диаметре) полупрозрачные колонии, воздушный мицелий слабо развит, локализован по краям колоний, пигмент не образуется.

На сусло-arape с 0,5% мела растет медленно,.колонии мелкие (до 5 мм), слабо развитый воздушный мицелий появляется на 7 сут, пигмент не образуется.

Физиологические признаки.Желатину не разжижает. Молоко подщелачи.вает и пептонизирует без коагуляции на 10-12 сут ° при 28 С. Сероо водород и индол не образует. Нитраты не востанавливает. В качестве источника углерода потребляет глюкозу, галактозу, мальтоэу, глицерин, маннит, лимонную кислоту, хуже растет на манноэе, фруктозе, рамноэе, янтарной и пировиноградной кислотах. Не потребляет ксилозу, инулин, сорбит, инозит, дульцит, зскулин, щавелевую и уксусную кислоты.

Оптимальная температура роста

28 — 30с<С. При 20 С рост удовлетворительный, воздушный мицелий слабо развит. При 37оС рост очень слабый, без воздушного мицелия. при 50 С роста нет.

Антимикробный спектр. Предлагаемый штамм Ас с<<<о<пмсеь ссх гепс <.

Пример. Получение холестериноксидазы иэ мицелия hrtinornvrc

lavenA

Посевным материалом служит жидкая односуточная культура Actinornvce; с <ч«»<< о ВКМ-А591, выращенная на среде следующего состава,Ъ: глюкоза 0,5, аспарагин 0,05, дрожжевой экстракт 0,1, рН 7,0-7,2, Выращива-, ние биомассы проводят ферментерах объемом 100 л на вышеуказанной среде.

Количество посевного материала составляет 7,0Ъ от -объема среды, Длительность выращивания 22 ч. При таком культивировании получают 2,0 г сухой биомассы иэ 1 л жидкой культуры.

734264

РгоасИттотт чееэ ет ч1Ьт ороВ s

О, 7-2

0,01

Actino cnvces

Гаме гidu Pa e

1, 5-2

1,5

0,04-0,06

Формула изобретения

ЦНИИПИ Заказ 2007/35 Тираж 522 Подписное

Филиал ППП Патент, r, Ужгород, ул. Проектная,4

Как видно из таблицы, предлагаемый штамм AcUnornvces Ьмченс оЯс е отличается от РгocactinomYces етvÞãopo9is более высокой удельной активностью в расчете на белок (в 4-6 раз) при одинаковом выходе биомассы. Кроме того, в отличие от Рсоас потпчсе 5 .ervthropo9l5, который выращивается на сложной среде, содержащей большое количество компонентов, для выращивания биомассы Actin om ces

& endu oe применяется простая среда. Клеточные стенки Aetnnnmyces o

venavenauEcxe может быть легко обработано для получения и накопления фермента. Антибиотическая активность

Ас лттотпчсе Pavenc3uQne предотвращает развитие инфекции в культуре, что особенно важно при выращивании в больших объемах.

Штамм Actinornvccs poven u Рае

BKt4-А59 1 — продуцент холестеринокЬидаэы. Хранится во Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганиэМов ИНМИ AH СССР.

Морфологические признаки. Актиномицет, имеющий разветвленный мицелий около 1 мкм в поперечнике. Спороносцы с примитивными спиралями около 0,5 витка, одиночные.

Споры овальные с гладкой оболочкой.

Физиологические признаки, Рост на органической среде. На картофельном

arape рост хороший, колонии круглые, выпуклые, белого или сероватого цвета. В пробирках со скошенным картофельным arapoM при посеве штрихом окраска воздушного мицелия серая с розрвым оттенком (цвет лаванды). На ломтиках картофеля воздушный мицелий скудный„ серого цвета. Ломтики картофеля приобретают бурую окраску.

На мясо-пептонном бульоне рост в виде пристеночного кольца на поверхности, затем образуются хлопья, оседающие на дно: с образованием осадка.

Рост на синтетической среде. На агаризованной систетической среде

Чапека с глюкозой рост слабый. Колонии до 5 мм в диаметре, воздуш-. ный мицелий слабо развит, появляется на 7-8 сут.,локализован йо краям колоний, пигмент не образуется.

Молоко подщелачивает, пептониэирует без коагуляции на 10-12 сут. при 28 С.

Желатину в течение 14 сут. при

30 С не разжижает.

Индол не образует. Сероводорода не образует.

Нитраты не восстанавливает.

Отношение к источникам углерода.

Усваивает глюкозу,галактозу,мальтозу, глицерин,маннит,лимонно-кислый калйй.

Слабый рост на маннозе,фруктозе,рамноэе,янтарнокислом натрии,пировинограднокислом натрии.Не ассимилирует ксилозу, арабиноэу, сахарозу, лак45 тоэу, раффиноэу, крахмал, инулин, целлюлозу, сорбит, инозит, дульцит, эскулин, щавелевокислый натрий, уксуснокислый аммоний.

Антимикробный спектр.,Подавляет рост грам-положительных бактерий и слабо активен против грам-отрицательных бактерий.

Ферментативные свойства. Является активным продуцентом холестеринокси- . дазы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент ФРГ Р 2224133, кл. С 12 D 13jlO 1973.